β-珠蛋白基因5'远端新型沉默子的克隆和定点诱变

一、β珠蛋白基因5′远端新沉默子克隆及定点诱变（论文文献综述）

周鹭^[1]（2018）在《血小板无力症的临床异质性分析和基因编辑探索》文中研究表明第一部分97例汉族血小板无力症临床和基因特点分析血小板无力症（Glanzmann’s thrombasthenia,GT）是一种罕见的遗传性出血性疾病。为常染色体隐性遗传,多见于近亲婚配家庭。患者多表现为自幼发生中重度的皮肤黏膜出血。血小板形态和数量正常,但对ADP、凝血酶等生理诱聚剂反应低下或者缺如,对瑞斯托霉素的聚集功能正常。ITGA2B和ITGB3基因突变引起血小板膜表面αIIbβ3质或量的异常是导致血小板无力症的根本原因。本研究收集并分析了来自中国汉族93个家庭的97例血小板无力症患者的临床资料,对其中45例患者进行了基因检测。结果显示仅有18.3%的患者来自近亲结婚家庭,明显低于其他国家血小板无力症患者的近亲婚配比例。与其他种族相比,汉族人口在血小板无力症类型的分布上没有明显差异,以Ⅰ型血小板无力症最为多见,Ⅲ型血小板无力症最为少见。血小板无力症患者出血严重程度具有异质性,有些患者出血症状很重,而有些患者出血表现不明显。部分患者（25.2%）随着年龄增长出血症状明显缓解。女性比男性患者出血症状更重,自行缓解的比例更低,总体死亡率更高,预后较差。在45名基因检测患者中,我们共发现了43种不同位点的ITGA2B或ITGB3基因变异,其中25种未有报道。这些变异包括14种错义变异,4种无义变异,4种移码变异和3种剪切位点变异。其中11种是“致病性变异”,14种是“疑似致病性变异”。45名患者中,15名为纯合子,21名为复合杂合子,7名仅检测到一个杂合变异,另有2名患者未在ITGA2B和ITGB3基因上检测到变异。ITGA2B基因的c.1750C>T（p.R584X）,c.2671C>T（p.Q891X）,c.2333A>C（p.Q778P）变异和ITGB3基因的c.1199G>A（p.C400Y）变异分别出现在7、4、7和2个无关家庭中。提示这几个变异是中国汉族血小板无力症的热点变异。具有相同基因型的血小板无力症患者表现为相同的血小板无力症类型,但出血严重程度不尽相同。这表明血小板无力症的临床表型不仅仅依赖于基因型,还与其他因素有关。我们的研究为进一步认识血小板无力症表型的异质性提供了依据。第二部分血小板无力症临床异质性的分子机制研究为了进一步探明血小板无力症患者临床异质性的原因,我们选取了一例特殊的血小板无力症患者进行机制研究。GT39是一位25岁男性,25年来只表现过一次异常出血,无其余特殊出血表现。基因检测发现该患者在ITGA2B基因上具有复合杂合变异c.2570G>T（p.C857F）和c.1769G>A（p.R590Q）。体外细胞模型表明c.2570G>T（p.C857F）和c.1769G>A（p.R590Q）突变质粒使αIIb表达中度下降,但是功能完全丧失,表明该患者是一个变异型GT患者,且ITGA2B c.2570G>T（p.C857F）和ITGA2B c.1769G>A（p.R590Q）这两个变异是导致GT39发病的致病突变。其机制可能通过破坏C857-C911二硫键的连接、改变第590位氨基酸的极性影响αIIbβ3的功能。该患者虽然表现为血小板聚集功能异常,然而出血表现非常轻,这表明除了ITGA2B基因变异以外,可能还存在其他因素影响血小板无力症的出血表现。第三部分三个无义突变的血小板无力症家系基因分析ITGA2B或者ITGB3基因的无义突变是导致血小板无力症的常见原因。患者往往表现为血小板膜表面αIIbβ3明显减少甚至缺如的I型血小板无力症。然而这类患者的出血表现却存在异质性。为了进一步探明无义突变的血小板无力症患者的发病机制,探索其异质性的原因,我们研究了三个无义突变的血小板无力症家系。通过分析三个家系患者DNA,c DNA,总蛋白表达,血小板膜表面蛋白表达情况,我们发现三位先证者无义突变的基因转录后同时存在无义突变介导的m RNA降解（NMD）和无义突变相关的剪切改变（NAS）两种情况。m RNA水平的表达差异可能是导致出血异质性的原因。针对NMD和NAS的PTC124以及反义寡核苷酸治疗可能成为治疗无义突变的血小板无力症的潜在可行的治疗方法。我们的研究为血小板无力症的精准治疗提供了理论依据。补充部分无义突变的血小板无力症基因编辑探索为了进一步探索无义突变的血小板无力症的治疗,我们使用CRISPR/Cas9技术对Meg01细胞进行基因编辑,拟建立无义突变的人巨核细胞Meg01细胞模型。通过设计guide RNA,构建Crispr质粒,转化DH5α,抽提质粒,转染Meg01细胞,抽提DNA验证,筛选出了对Meg01细胞的ITGA2B基因具有剪切活性的guide RNA。

杨宇,陈玉祥,刘水平,易伟峰,陈铁骅,文继舫,胡维新^[2]（2001）在《人类杀菌肽基因cDNA片段的克隆》文中研究表明采用 RT-PCR方法 ,从慢性粒细胞白血病患者的外周血白细胞中扩增得到长度约为 1 .5kb1的人类杀菌肽 c DNA,并进一步得到长度约为 60 0 bp的该多肽的氨基端部分 c DNA扩增产物 .将上述两种长度的扩增产物分别克隆至 p UCm-T载体中 ,为进一步开展该重组抗菌肽的表达和活性研究奠定了基础 .

杨宇,杨友云,李厚敏,朱定尔^[3]（2001）在《β珠蛋白基因5′远端新沉默子的结构和功能》文中研究说明通过凝胶滞留分析和荧光素酶报告基因检测系统 ,鉴定出人类 β珠蛋白基因 5′旁侧远端帽位上游- 2 132～ - 182 2bp间存在一个活性沉默子片段 （310bp）。通过DNA足迹分析 ,对其DNA序列与从Hela细胞核中提取的DNA结合蛋白 （核蛋白 ）的相互作用进行了研究 ,结果显示该DNA片段中存在两个相邻的核蛋白结合位点 ,分别为帽位上游 - 2 0 17～ - 2 0 11bp间序列“CTTCCGC”和 - 2 0 0 6～ - 1997bp间序列“CACTTTATTT”。采用人工设计的突变引物 ,分别将上述两段序列定点诱变为“CTTAAGC”和“CACTTAAGTT” ,从而形成两种突变型 310bp片段 ,经竞争性凝胶滞留分析 ,显示这两种突变型片段以及它们分别经限制酶BspTI消化产生的 4个小片段均丧失了与野生型 310bp片段探针竞争核蛋白的能力 ;而采用人工合成包含正常“CTTCCGC”和“CACTT TATTT”序列的双链寡核苷酸片段进行竞争性凝胶滞留分析 ,结果显示它具有与野生型 310bp片段探针竞争DNA结合蛋白的能力 ,从而验证了这两段序列是存在着相互作用的核蛋白结合位点。与此同时 ,采用DNA结合蛋白纯化试剂盒 ,对Hela细胞核蛋白提取物中的特异性DNA结合蛋白进行亲和素磁性分离纯化 ,经蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染鉴定 ,结果显示确实存在两种DNA结合蛋白分别与此?

杨宇,李厚敏,杨友云,朱定尔^[4]（2000）在《β珠蛋白基因5′远端新沉默子克隆及定点诱变》文中研究表明通过凝胶滞留分析和荧光素酶报告基因检测系统 ,鉴定出人类 β珠蛋白基因 5′旁侧远端帽位上游 - 2 1 32～ - 1 82 2 bp间存在一个活性沉默子片段 （31 0 bp） ,将其亚克隆至p UC- T载体中 ,然后采用人工设计的突变引物 ,将经 DNA足纹分析确定的两个结合位点的核心基序 （β珠蛋白基因帽位上游 - 2 0 1 7～ - 2 0 1 1 bp间的“CTTCCGC”序列和 - 2 0 0 6～ -1 997bp间的“CACTTTATTT”序列 ）分别定点诱变为“CTTAAGC”和“CACTTAAGTT”两个突变序列 ,从而构建成两种突变型 31 0 bp片段 ,可用于对活性沉默子位点的结构与功能及β珠蛋白基因表达调控机制的深入研究 .

二、β珠蛋白基因5′远端新沉默子克隆及定点诱变（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、β珠蛋白基因5′远端新沉默子克隆及定点诱变（论文提纲范文）

（1）血小板无力症的临床异质性分析和基因编辑探索（论文提纲范文）

四、β珠蛋白基因5′远端新沉默子克隆及定点诱变（论文参考文献）

• [1]血小板无力症的临床异质性分析和基因编辑探索[D]. 周鹭. 苏州大学, 2018(06)
• [2]人类杀菌肽基因cDNA片段的克隆[J]. 杨宇,陈玉祥,刘水平,易伟峰,陈铁骅,文继舫,胡维新. 生命科学研究, 2001(02)
• [3]β珠蛋白基因5′远端新沉默子的结构和功能[J]. 杨宇,杨友云,李厚敏,朱定尔. 生物化学与生物物理学报, 2001(03)
• [4]β珠蛋白基因5′远端新沉默子克隆及定点诱变[J]. 杨宇,李厚敏,杨友云,朱定尔. 生命科学研究, 2000(04)

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