一、Isolation and genetic charac-terization of a fragile plant mutant in rice (Oryza sativa L.)（论文文献综述）
张涛荟,王海宇,万华,张莉萍,谢振威,陈可毅,何晓栋,赵志刚,万建民[1]（2022）在《水稻雌雄不育突变体Osfma2的细胞学观察及基因图位克隆》文中研究表明【目的】通过构建分离群体定位并克隆水稻雌雄不育基因OsFMA2,并对其在水稻育性调控中的功能进行探究。【方法】通过EMS诱变水稻宁粳4号得到稳定的不育突变体,对突变体进行表型及细胞学观察,利用精细定位和Mut-map相结合的方法克隆了水稻雌雄不育基因Os FMA2,通过实时荧光定量PCR检测其在各组织表达水平差异,利用水稻原生质体表达系统进行OsFMA2蛋白的亚细胞定位。【结果】细胞学观察发现突变体为雌雄不育。利用极端个体将其精细定位于水稻第6染色体长臂448 kb的区间内。结合全基因组重测序结果,最终确定Os FMA2为目标基因。该基因编码一个复制蛋白,在单子叶植物中高度保守。OsFMA2具有组织特异性,在幼穗中高表达。亚细胞定位结果显示OsFMA2蛋白定位于细胞核中。【结论】Os FMA2在幼穗中高表达,可能参与了水稻雄配子第一次减数分裂前期同源重组过程,同时,Os FMA2的表达对雌配子发育也产生了不利影响。
宋亚楠[2]（2021）在《亚麻荠WRKY转录因子家族的鉴定及其介导盐胁迫响应的功能研究》文中认为特色油料作物亚麻荠（Camelina sativa）不仅种子富含ɑ-亚麻酸（18:ω3）,是制备高端功能性油脂产品的优质资源,而且具有生育期短（80-100天）、水肥消耗低、病虫草害少和易于简化栽培等优良农艺性状,是发展低耗高效可持续农业生产体系的一个理想作物。特别是,与油菜和大豆等作物相比,亚麻荠抵御低温、干旱和盐胁迫等逆境能力强,是挖掘优异抗逆性基因资源的突特种质。植物特有的WRKY转录因子蛋白家族,参与植物生长发育以及抗逆反应等多种生命活动。然而,有关亚麻荠抗逆性机制以及WRKY转录因子种类、进化及功能还鲜见报道。本文聚焦于鉴定介导亚麻荠抗盐胁迫机制WRKY转录因子等关键基因。以亚麻荠品种SC-N1为试材,系统检测亚麻荠盐胁迫响应表征;应用RNA-seq进行亚麻荠盐胁迫响应的转录组学分析,筛选参与亚麻荠盐胁迫响应的转录因子;全基因组鉴定亚麻荠WRKY家族成员和表达谱,解析WRKY家族系统进化和功能变异,确定介导亚麻荠盐胁迫抗性的候选WRKY转录因子;应用单细胞光自养模式植物莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的遗传转化体系检测候选的亚麻荠盐胁迫响应CsWRKY的功能;培育目标CsWRKY过表达以及CRISPR-Cas9敲除的亚麻荠转基因株系,分析转基因株系生理生化表型,鉴定介导亚麻荠盐胁迫响应的CsWRKY及其生物学功能。本研究将为挖掘亚麻荠耐盐的相关基因、解析亚麻荠响应盐胁迫的分子调控机制提供科学依据。主要研究结果如下:1.亚麻荠幼苗盐胁迫响应的表征于水培条件下,选取6片真叶幼苗进行盐胁迫处理,检测幼苗形态和生理生化相关参数。与对照（1/2 Hoagland营养液）相比,盐胁迫3 d的幼苗发生叶片萎蔫和生长减缓等受害症状,且呈现剂量效应。三个不同剂量（100、150和200 m M）Na Cl处理的亚麻荠幼苗株高分别降低了25.26%、37.59%和44.58%,地上部鲜重分别降低了3.22%、13.44%和21.51%,地下部鲜重分别降低了41.18%、47.06%和50.0%,叶绿素a（Chla）含量分别降低了10.29%、27.94%和32.35%,叶绿素b（Chlb）含量分别降低了28.26%、52.17%和56.52%。盐胁迫导致幼苗叶绿素荧光参数（Fm、Fv/Fm、Y（II）、q P和ETR）及光合作用减低。相反,盐胁迫（200 m M）处理的幼苗抗渗物质显着增加,类胡萝卜素、脯氨酸、可溶性糖含量分别比对照提高了40.0%、10.6倍和47.0%。SOD（超氧化物歧化酶）和POD（过氧化物酶）活性和T-AOC（总抗氧化能力）比对照提高了51.86%、156.89%和50.18%。此外,盐胁迫幼苗的过氧化氢酶（CAT）活性高于对照约4倍。显然,亚麻荠能通过提高抗渗物质合成积累和增强抗氧化酶活及清除活性氧（ROS）能力而抵御盐胁迫。2.亚麻荠幼苗转录组分析与盐胁迫响应的转录因子筛选为发掘亚麻荠的耐盐基因和揭示盐胁迫应答调控机制,利用RNA-Seq技术对175 m M Na Cl胁迫处理1 d的亚麻荠幼苗及其对照材料进行转录组分析。结果显示,共获得亚麻荠转录组数据42.47Gb,组装得到功能注释的99402条Unigenes和5902个差异表达基因（DEG）（2917个上调和2985个下调）。GO富集分析发现,较多数量的DEGs主要集中在分子功能（33.60%）、细胞组分（13.60%）和生物过程中（52.79%）。KEGG途径分析将1442个DEGs注释到44条代谢通路,其中,上调DEGs显着富集到抗坏血酸和醛酸代谢、精氨酸脯氨酸代谢,氧化磷酸化以及苯丙烷类合成途径,下调DEGs主要参与光合作用。进一步对差异表达基因综合分析,筛选到较重要的转录因子家族,包括WRKY、MYB、b HLH、AP2/ERF和b ZIP等。其中,WRKY转录因子基因上调表达数目多、水平高,预示着WRKY转录因子在亚麻荠幼苗盐胁迫应答过程中发挥更加重要的作用。3.亚麻荠CsWRKY转录因子全基因组鉴定及系统进化分析应用组学分析工具从亚麻荠基因组共鉴定到242个CsWRKY蛋白成员,由不均匀分布在20条染色体的224个CsWRKY基因编码,其中15个CsWRKY基因产生33个WRKY可变剪接体。依据WRKY和锌指基序,CsWRKY家族成员分为3大类（I、II和III）,其中第II大类含有149个WRKYs,又分为5个亚类（IIa、IIb、IIc、IId和IIe）。CsWRKY蛋白含有的10个保守基序,其中特有的WRKYGQK七肽最为保守。然而,多个IIc亚类的CsWRKYs检测到WRKYGXK、WRKYGKK和WRKYGEK等变异。这些变异可能导致CsWRKY蛋白功能多样化。CsWRKY基因家族进化经历了较强的纯化选择（purifying selection）,未发现随机重复（tandem duplication）,但发生了137个片段重复事件（segmental duplication event）,构成亚麻荠CsWRKY基因家族扩张和功能变异的关键进化驱动力。此外,分别检测到166和173个CsWRKY基因对应于65个At WRKY和111个Br WRKY（Brassica rapa）直向同源基因,预示着亚麻荠WRKY基因家族扩张可能发生在拟南芥与油菜分离之后。4.亚麻荠CsWRKY基因时空表达谱分析与介导盐胁迫应答的CsWRKY筛选应用亚麻荠根、茎、叶、花和种子等12个不同组织器官的转录组数据,分析CsWRKY基因表达谱显示,54%CsWRKY基因至少在一种组织器官表达,在根、茎、成熟叶、花和发育早期种子表达的基因分别占89.11%、80.69%、78.71%、88.61%和76.73%。70个CsWRKYs在12个组织器官均表达,其中高表达基因24个。许多CsWRKY基因具有组织特异性表达模式,例如,在两个组织/器官表达的,CsWRKY25和34在花序和发育晚期种子,CsWRKY174在萌发种子和根,CsWRKY73和203在花和成熟叶。仅在一个组织/器官表达的有,根组织的CsWRKY111、208和226,花组织的CsWRKY182和202,以及早期发育种子的CsWRKY204。这些结果表明CsWRKY在亚麻荠组织/器官发育过程中起重要作用,其中一部分CsWRKYs可能参与调控细胞基础生命活动,而另一部分CsWRKYs则在不同组织/器官行使差异化调控功能。应用盐胁迫亚麻荠幼苗转录组数据和实时荧光定量PCR检测相关CsWRKY基因的表达谱,筛选出CsWRKY8、9、10、43、48、49、50、162和242共9个基因为重要的介导盐胁迫应答CsWRKYs。盐胁迫幼苗地上组织中,这9个基因均上调表达,其中CsWRKY9、CsWRKY43和CsWRKY162表达水平高于对照组织的5倍以上。在盐胁迫根组织中,CsWRKY9、43和162亦上调表达,表达量高于对照组织6倍多。然而,CsWRKY8和10则显着下调表达（p<0.05）,其他4个CsWRKYs表达量上调未达显着水平（p<0.05）。5.应用莱茵衣藻遗传转化体系鉴定亚麻荠CsWRKY9、43和162基因的功能对低等植物和高等植物WRKY转录因子家族分析发现,单细胞光自养模式植物莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的基因组仅有1个WRKY基因。应用莱茵衣藻过表达异源WRKY基因研究其功能,能有效排除宿主内源多个WRKY基因的干扰。同时,我们获得了莱茵衣藻WRKY突变体LMJ605及其野生型株系CC5325。这为鉴定本文筛选到的亚麻荠盐胁迫响应的候选CsWRKY功能提供了独特的测试宿主种质。从上文9个候选CsWRKYs中选择最重要的CsWRKY9、43和162为目的基因,将其分别克隆入适于在莱茵衣藻细胞表达的p HR13载体多克隆位点,构建过表达载体p HR13-CsWRKY9,p HR13-CsWRKY43和p HR13-CsWRKY162。采用玻璃珠法将表达载体分别导入易遗传转化的莱茵衣藻藻株CC849,经过分子检测获得目的基因稳定有效表达的转基因莱茵衣藻株系。检测未转化的对照藻株（CC849）和转基因藻株在正常培养条件和盐胁迫下的生长表型,结果发现,正常培养条件下,转基因藻株生物量和光合作用等性状略高于对照藻株,但未达显着水平（p<0.05）。在150 m M Na Cl盐胁迫条件下培养4 d后,对照藻株CC849以及转化株CsWRKY9、43和162的生物量比正常培养条件的生物量分别降低了33.57%、25.85%、14.47%和8.63%。在175 m M Na Cl盐胁迫条件下培养4 d后,对照藻株CC849以及转化株CsWRKY9、43和162的生物量比正常培养条件的生物量分别降低了59.40%、27.22%、18.79%和16.31%。检测叶绿素含量及叶绿素荧光参数显示,盐胁迫抑制藻细胞光合作用,但转基因藻株受害程度显着低于对照CC849（p<0.05）。进一步比较藻株CC849、藻株CC5325及其WRKY突变体LMJ605和转化藻株CsWRKY162在正常培养条件和盐胁迫下的表型显示,莱茵衣藻内源WRKY基因的功能缺失（LMJ605）未明显抑制正常培养条件下藻细胞的生长和光合作用。然而,在盐胁迫条件下,突变株LMJ605生长严重受阻。在150 m M Na Cl盐胁迫条件下培养,对照藻株CC849、CC5325、LMJ605和转化藻株CsWRKY162的生物量与正常条件下相比,分别减少了33.26%、10.50%、58.04%和11.54%。在175 m M Na Cl盐胁迫条件下培养,藻株CC849、CC5325、LMJ605和转化藻株CsWRKY162的生物量分别比正常培养降低了56.69%、25.68%、67.54%和17.21%。当盐浓度达到200 m M Na Cl时,藻株CC849、CC5325、LMJ605和CsWRKY162随着培养时间延长,藻细胞生长严重阻滞直至完全死亡,其中LMJ605受害最重,转化藻株CsWRKY162则受害相对轻,存活期比对照株（CC849）延长2倍多。这些莱茵衣藻遗传转化试验结果表明,CsWRKY9、CsWRKY43和CsWRKY162均能显着提高宿主细胞的抗/耐盐性,其中CsWRKY162功效最强。6.亚麻荠CsWRKY162过表达及CRISPR/Cas9敲除突变体的构建和表型分析选择CsWRKY162分别构建其过表达和CRISPR/Cas9敲除的亚麻荠突变体,深入解析CsWRKY162介导亚麻荠盐胁迫应答机制。成功构建CsWRKY162基因过表达载体p CAMBIA1303-CsWRKY162以及敲除载体CRISPR-CsWRKY162＿ta/b和CRISPR-CsWRKY162＿tc/d。应用农杆菌介导的浸花法将构建的载体分别导入亚麻荠,获得T0代种子,经筛选和鉴定,获得纯合CsWRKY162转基因植株,以及CsWRKY162基因敲除植株（含敲除载体CRISPR-CsWRKY162＿ta/b）,CsWRKY162基因序列发生了碱基缺失和替换。转基因植株表型分析显示,正常生长条件下,CsWRKY162过表达植株生长发育与对照植株差异不明显。在175 m M Na Cl盐胁迫条件下,对照植株生长受抑制,CsWRKY162过表达植株株高和单株鲜重分别是对照株1.5倍和1.3倍多。CsWRKY162过表达植株未显受害症状。在正常条件下,CsWRKY162基因敲除植株生物量等性状与对照株相比没有明显变化。在175 m M Na Cl盐胁迫条件下,CsWRKY162基因敲除植株矮小,其受害症状显着大于对照植株,其中,株高比对照植株降低了20%左右,单株鲜重比对照植株降低了40%左右。在亚麻荠响应盐胁迫过程中,胁迫相关基因NHX2、HKT和NCED3在CsWRKY162过表达株系和敲除株系中的表达分别上调和下调。亚麻荠遗传转化试验再次证明CsWRKY162是介导亚麻荠盐胁迫应答的一个极为重要的转录因子。有关这些亚麻荠转化体的转录组测序以及相关分析正在进行中,以期进一步阐明CsWRKY162介导的亚麻荠盐胁迫抗性表达机制和调控网络。综上所述,本文论述了亚麻荠盐胁迫响应的表征,全基因组系统鉴定了亚麻荠WRKY转录因子及其表达谱,揭示了CsWRKY家族成员的进化特征。筛选到9个介导亚麻荠盐胁迫响应的CsWRKY转录因子。应用独特的单细胞模式植物莱茵衣藻遗传转化体系评价了CsWRKY9、CsWRKY43和CsWRKY162的功能,成功构建了亚麻荠CsWRKY162过表达和敲除突变体,论证了CsWRKY162是正调控亚麻荠盐胁迫抗/耐性机制的一个重要转录因子。本文为全面解析各CsWRKY家族成员的功能以及抵御盐胁迫等逆境的分子机制和培育抗逆性优良的品种提供了新知识,靶标基因及相关研究基础。
孙硕[3]（2021）在《多组学分析揭示转录和表观遗传变化对于水稻适应缺铁环境的作用》文中认为铁（Fe）是植物必需的微量营养元素,缺铁对植物生长、产量和食物品质有重要影响。目前关于水稻缺铁的研究主要集中在调控铁稳态的功能基因的挖掘及基因调控关系的研究,对于表观遗传修饰和非编码RNA在水稻响应缺铁环境时的动态变化及其对于水稻适应缺铁环境所扮演的角色尚不明确。为此,本研究以野生型水稻为研究材料,通过全基因组亚硫酸氢盐测序（甲基组测序）、转录组测序、链特异性RNA测序、小RNA测序和降解组测序,揭示了水稻在缺铁环境下发生的DNA甲基化、mRNA和非编码RNA表达模式的变化,通过生物信息学分析发现了不同组学响应缺铁的内在关联,并结合分子实验验证了DNA甲基化变化对于水稻适应缺铁环境的关键作用。主要内容及结论如下:（1）在正常铁含量和缺铁的条件下,对水稻根和地上组织进行了全基因组DNA甲基化测序。结果发现,水稻在经历缺铁后会在基因附近产生大量以CHH类型为主的超甲基化区域,且普遍出现在转座子（TE）区域。转录组测序数据表明转座子的表达水平变化与差异表达基因的变化呈显着负相关。对差异表达基因的转录变化与DNA甲基化变化关联分析发现,只有少部分差异表达基因发生了差异甲基化,其中包括了能够调控几乎所有缺铁响应基因的铁信号通路核心转录因子OsbHLH156和IRO2。此外,发生差异甲基化的能够调控铁稳态的基因的转录变化也与DNA甲基化变化呈显着正相关。（2）为了验证DNA甲基化变化在水稻应对缺铁环境的作用,通过外源施用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（Aza）,研究了甲基化变化对缺铁水稻的生理和分子反应的影响。这导致水稻铁信号传导途径中核心转录因子的DNA甲基化水平降低,植株生长和铁含量降低。考虑到Aza处理可能对水稻造成未知的毒性,本研究针对全基因组CHH类型甲基化水平显着降低的osdrm2突变体进行了与Aza实验相同的表型分析和基因表达分析,结果支持了Aza处理的有效性和可靠性。（3）通过小RNA测序发现24-nt的小RNA是受缺铁影响变化最大的一类。由于RdDM主要由24-nt siRNA介导,本研究鉴定了不同长度缺铁响应的siRNA簇,并重点对24-nt siRNA覆盖区域的特征进行了进一步探索。结果表明,受缺铁诱导基因的表达水平在根和地上组织中均与其附近（2kb内）的24-nt siRNA簇呈高度正相关。进一步研究siRNA介导的DNA甲基化与缺铁引起的DNA超甲基化之间的关系发现,相较于基因组随机区域,CHH类型的超甲基化区域的24-nt的siRNA的丰度显着增加。此外,本研究还鉴定到一些之前未报道过的缺铁响应miRNA（如mi R396等）,并通过降解组测序验证了其靶基因。（4）通过对水稻链特异性RNA测序,在全基因组范围内鉴定了缺铁响应的lncRNA。本研究共鉴定出6,477个lncRNA,其中,地上组织中分别有47个缺铁上调和33个缺铁下调lncRNA。而根中分别有89个缺铁上调和32个缺铁下调的lncRNA。两个lncRNA（XLOC＿010112和XLOC＿053944）被鉴定为缺铁响应miRNA的潜在前体,另外两个lncRNA（XLOC＿012715和XLOC＿054182）被鉴定为参与铁调节的miRNA的模拟靶点（e TM）。许多DE-lncRNA可能通过顺式或反式调节模式调节Fe相关基因,包括位于OsbHLH156和Os HRZ2基因组区域附近的3个DE-lncRNA（XLOC＿034336、XLOC＿037283和XLOC＿043545）。在转录水平上,有76个DE-lncRNA被OsbHLH156调控。本研究首次探究了lncRNA在缺铁条件下的表达模式,以及可能在铁稳态调控中发挥重要作用的lncRNA,这是了解水稻铁调控网络的重要基础。
陈雷[4]（2021）在《水稻花期耐热性与耐热QTL定位及候选基因分析》文中认为近年来,全球气候变化日益严重,极端高温天气的发生越来越频繁,高温已成为威胁水稻安全生产最主要的非生物胁迫之一。开花期是水稻对温度变化极为敏感的时期,也是决定籽粒产量最关键的阶段。因此,研究水稻花期耐热生理特性,鉴定不同水稻基因型耐热性,发掘水稻耐热基因资源,进而培育耐热新品种以应对气候变暖的威胁,具有重要意义。本研究基于水稻高温危害积温与颖花相对结实率的关系,探讨水稻耐热性鉴定方法并鉴定评价不同水稻基因型耐热性,进而为水稻实际生产筛选出耐热性强、产量水平高的品种,为耐热水稻育种筛选出优良供体材料;以不同耐热性水稻品种响应高温胁迫的差异性反应,明确水稻花期耐热生理基础;以耐热品种和高温敏感型品种杂交获得的遗传后代群体开展水稻花期耐热性QTL定位及其候选基因分析,为耐热水稻品种选育提供理论基础和供体材料。主要结果如下:1.建立了水稻花期耐热性鉴定方法以桂两优2号、良丰优339和N22为研究材料,以自然条件下生长植株为对照,在人工气候室设置不同的高温处理（35和38℃）和持续时间（2、4、6、8和10 d）,于水稻花期始起进行高温处理,成熟后计算高温颖花相对结实率（RSF）。结果表明,以32℃为高温危害临界温度,RSF与高温危害积温（Ta）之间呈负指数关系(RSF=117.9·e-0.01Ta,R2=0.82*,P<0.05),以相对结实率为50%时的高温危害积温,结合水稻开花习性,确定了在人工气候室于水稻花期进行高温38℃每天处理6 h（9:30-15:30）连续处理3 d的方法,可以科学快速有效地区分不同水稻基因型间的耐热性差异。2.鉴定出花期耐热性差异显着的水稻基因型在人工气候室模拟水稻花期高温胁迫,以高温胁迫下的结实率和相对结实率结合产量高低水平为评价指标,对100个不同水稻基因型的耐热性进行鉴定与评价。结果表明,不同水稻基因型间在花期耐热性和产量潜力上均存在显着差异;综合高温胁迫下结实率表现和产量水平,通过聚类分析筛选出特优837、云光14号、Q优8号、国稻7号、Y两优865、汕优63和黄华占等耐热性强、产量水平高的品种和OM4900、882H、93-11等高温敏感型品种。3.明确了高温胁迫下剑叶保持较高的光合特性、可溶性蛋白、脯氨酸含量和抗氧化酶活性以及较低的MDA含量是水稻花期耐热生理基础以不同耐热性水稻品种（Y两优1号和良丰优339）开展高温胁迫下水稻花期耐热生理基础研究。结果表明,在38℃高温胁迫下,Y两优1号比良丰优339更耐热,具有较高的颖花育性;净光合速率和SPAD值均下降,但与高温敏感型品种相比,耐高温品种在高温胁迫下Pn下降相对较小而能保持较高的光合能力;高温胁迫使剑叶可溶性糖、可溶性蛋白含量降低,而脯氨酸含量升高;高温胁迫下,高温敏感型品种的丙二醛（MDA）含量增加幅度比耐高温品种更为显着;耐高温品种比敏感品种更能保持较高的抗氧化酶活性。因此,高温胁迫下,水稻剑叶保持较高的光合特性、可溶性蛋白、脯氨酸含量和抗氧化酶活性以及较低的MDA含量是水稻花期耐高温的生理基础。4.挖掘出水稻花期耐热QTL 1个（q HTT8）及2个候选基因（LOC＿Os08g07010和LOC＿Os08g07440）以水稻耐高温品种黄花占与高温敏感品种93-11杂交获得的F2:3群体为材料,对水稻花期耐热性QTL进行定位。基于BSA-seq方法,在第8染色体上发现了一个控制水稻花期耐热性的主效QTL-q HTT8。q HTT8候选区域包含65个预测基因,其中有10个预测基因与非生物胁迫耐受相关。利用q RT-PCR技术分析了这10个基因在高温条件下黄华占和93-11之间的差异性表达,其中,LOC＿Os08g07010和LOC＿Os08g07440在高温诱导下在黄华占上的相对表达量显着高于9311。进一步通过同源基因分析表明LOC＿Os08g07010和LOC＿Os08g07440可能是q HTT8的候选基因。本研究结果将为今后利用分子标记辅助选择技术克隆q HTT8和选育耐热水稻品种提供参考。
徐乾坤[5]（2021）在《水稻类病斑基因LML11的图位克隆与功能分析》文中研究说明水稻（Oryza sativa L.）作为全球最重要的粮食作物之一。在水稻的整个生长发育进程中常常会遭受周围环境中许多不利因素的影响,比如温度、湿度、光照、及各种病原菌等。这些不利因素通常会导致水稻植株发生ROS爆发、PCD、代谢途径紊乱、胼胝质累积及防卫反应相关基因表达量升高等,从而造成水稻类病斑性状的出现。水稻类病斑突变体通常在其叶片、叶鞘、茎秆或种子上自发形成大小、颜色等各异的坏死斑点。目前已鉴定的水稻类病斑突变体大多都提高了对一些病原菌的抗性,因此,水稻类病斑突变体是研究植物PCD和防卫反应发生机制的良好材料,研究和分析造成水稻类病斑表型产生的基因对了解水稻的抗病机制有重要意义。本研究中的类病斑突变体材料lml11（lesion mimic leaf 11）是通过EMS诱变粳稻品种中花11（ZH11）而来。我们主要对lml11突变体进行了包括表型分析、生理生化分析、种子灌浆、稻米品质、突变体种子发芽分析、抗病性分析、基因的克隆与功能分析、基因表达分析、生物信息学和转录组测序分析等方面的研究。通过这一系列的研究和分析,我们了解了lml11突变体类病斑表型的发生机制及其抗病性能,为水稻类病斑突变体的研究提供了理论参考。主要的研究结果如下:1.lml11突变体的表型特征:lml11突变体从三叶期时就已经表现出了红褐色类病斑性状。在分蘖期,lml11突变体叶片上的病斑更加明显且更为密集。进入抽穗期后,lml11突变体整个植株的叶片在两到三周时间内迅速布满红褐色的斑点,并导致叶片迅速枯死。农艺性状调查发现,lml11突变体的一些主要农艺性状如:株高、分蘖数、穗长、一次枝梗、二次枝梗、每穗粒数、每穗实粒数和结实率都表现出显着地下降。2.lml11突变体的生理生化特征:lml11突变体叶片中光合色素含量（如叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素）与野生型叶片相比呈现出极显着降低。光合速率测定显示lml11突变体叶片的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO2的浓度等与野生型叶片相比表现出明显的降低。组织化学染色结果表明,lml11突变体叶片DAB染色后出现褐色沉积,NBT染色后出现蓝色沉淀,H2DCFDA探针染色后叶片气孔处出现绿色荧光;生理指标测定结果显示,H2O2和MDA含量显着升高,CAT酶活显着下降,这些结果均表明lml11突变体的叶片中积累了大量的活性氧。TUNEL检测和彗星实验均显示lml11突变体叶片中存在大量细胞程序性死亡。遮光实验和6-BA处理则证明了黑暗处理条件可以导致lml11突变体叶片中叶绿体的迅速降解,并造成了叶片细胞的快速死亡,表明lml11突变体的类病斑表型可能是黑暗诱导的。3.lml11突变体的灌浆速率和稻米品质:对lml11突变体和野生型不同灌浆时期种子进行调查和统计分析显示,lml11突变体中一部分种子基本没有灌浆,另一部分种子也因为突变体植株叶片的迅速死亡无法完全灌浆。与野生型相比,同一时期lml11突变体灌浆籽粒的鲜重和干重都显着下降。拷种分析显示,lml11突变体的种子除长度外,其宽度、厚度和千粒重都比野生型种子显着下降;lml11突变体的糙米在长度、宽度、厚度和千粒重方面较野生型下降更为显着。种子的灌浆情况和千粒重常影响种子的品质。调查发现,lml11突变体的种子有较多垩白,种子不通透。与野生型相比,lml11突变体种子胚乳的横截面有条柱状突起,淀粉颗粒无棱角,多呈现出球形或无规则形态型,大小各异,淀粉颗粒与颗粒之间存在肉眼可见的缝隙,且排列松散。稻米品质检测显示lml11突变体种子的总淀粉含量、直链淀粉含量和可溶性糖含量都比野生型种子显着下降;lml11突变体种子的糊化温度比野生型显着升高;lml11突变体种子的蛋白质含量较野生型种子明显升高。4.lml11突变体种子发芽分析:LML11基因突变后导致突变体种子无法通过正常的浸种途径发芽。GA处理发现,将lml11突变体种子用1μM、5μM和10μM浓度的GA溶液浸泡后,可以显着提高其发芽率。在GA处理7天后,1μM、和5μM浓度的GA甚至可以将lml11突变体种子的发芽率提高到55%。但10μM浓度的GA对lml11突变体和野生型发芽种子的根长和芽长有一定的抑制作用。5.lml11突变体类病斑性状的形成是由基因突变所致:lml11突变体的类病斑表型受一对单隐性基因控制。我们使用图位克隆的方法将LML11基因定位在11号染色体分子标记M5和M6之间,该区间的物理距离为61.3 kb。测序发现LOC＿Os11g40590的CDS上第277个碱基G突变成了碱基A,导致氨基酸序列中第93个氨基酸由缬氨酸转变为了异亮氨酸。将野生型的LML11基因的完整序列导入到lml11突变体中,转基因植株表现出了与野生型类似的表型。将野生型的LML11基因敲除后,转基因植株也出现了类病斑的表型。因此,LOC＿Os11g40590即为LML11基因。组织表达实验表明LML11是一个组成型表达基因。GUS转基因染色还显示LML11基因在发芽种子的胚芽中表达,LML11基因在灌浆籽粒中的表达分析显示其在灌浆9天左右时表达量达到最高。亚细胞定位结果表明LML11在细胞质和细胞核中均有表达。6.LML11基因的生物信息学分析:LML11基因的CDS有2793个碱基,编码930个氨基酸。在LML11蛋白氨基酸序列的N端存在一段甘氨酸重复序列,说明LML11蛋白可能属于GRDP。多重序列分析发现LML11蛋白的同源蛋白序列在多个单子叶植物、双子叶植物及苔藓中都有一段保守的未知功能区域,说明这一功能区域在进化的过程中是非常保守的。分析发现突变体中LML11基因的突变位点刚好在这个保守的未知功能区域上,我们推测水稻lml11突变体类病斑表型的产生与该保守未知区域的功能丧失有关。7.lml11突变体的抗病性:与野生型相比,lml11突变体对两个白叶枯菌小种PXO99A和PXOzhe173表现出了很好的抗性。而三个超表达株系对两个白叶枯菌小种PXO99A和PXOzhe173的抗性与野生型相比没有显着性差异。与野生型和三个超表达株系相比,病程相关基因PR1a、PR1b、PBZI、NAC和PAL在lml11突变体中的表达量极显着升高。8.lml11突变体的转录组测序分析:转录组数据显示野生型和lml11的转录组测序质量合格,且样本之间的重复性很好。lml11突变体和野生型的DEGs分析显示,lml11突变体中有2149个基因的表达量下调,有3380个基因的表达量上调;lml11突变体中绝大部分参与植物免疫反应基因的表达量较野生型显着升高。lml11突变体和野生型差异相关基因的GO富集结果显示,包括氧结合（GO:0019825）、新陈代谢过程（GO:0009607）、次生代谢过程（GO:0019748）、胁迫反应（GO:0006950）和激酶活性（GO:0003824）等与ROS积累相关的生物学进程得到了显着性富集。KEGG通路富集结果显示光合作用通路和光合生物中的碳固定通路得到了富集,表明lml11突变体类病斑表型的产生影响了突变体叶片的光合作用。
郑莎[6]（2021）在《桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究》文中指出自从1958年耶鲁大学的科学家Lerner从牛的松果体中首次分离出褪黑素以及1995年Dubbels和Hattori等学者率先从高等植物番茄、牵牛花等植物中鉴定到褪黑素以来,褪黑素在动植物中的功能受到了科学家们的广泛关注和研究。大量研究表明:褪黑素能够参与到植物生长发育的各个阶段,参与调控植物的各种生理活动;在动物体内,褪黑素起着重要的时间生物学作用,调节昼夜节律,维持节律稳定,具有改善睡眠、治疗神经衰弱和提高免疫等功效。因此,褪黑素在日常生活中作为睡眠调节药物被广泛使用,常用于调整由飞行时差或其他睡眠失调导致的生物钟紊乱,从而改善人的睡眠觉醒周期和昼夜节律。随着我国经济的全球化和快速发展,人们由于频繁时差切换和高强度轮班工作等无规律生活节奏而导致其体内褪黑素分泌合成失调并引起昼夜节律失调的现象也越来越多。许多研究表明通过经常进食高褪黑素含量的动植物食药材能有效补充人体内褪黑素含量并维持其代谢稳态而改善昼夜节律失调。因此,寻找和研究褪黑素高含量的动植物食药原料,特别是高褪黑素含量的大众植物食药原料具有重要现实价值。桑树（Morus alba L.）原产于中国,一直作为家蚕饲料而被大量种植,自古以来便是中国主要经济作物之一。以往对桑树的研究,主要集中在桑树品种选育、桑树栽培和病虫害防治等方面,其目的是为家蚕提供高产、优质的桑叶饲料。随着对桑树的深入研究,发现桑树不同部位富含多种营养成分和活性物质,使得其营养价值和药用价值也受到人们的关注,因而被国家卫生部列为“药食同源”的植物资源。最近研究表明与其他许多中药材和水果相比,桑叶和桑葚都属于高褪黑素含量植物资源,被认为是补充褪黑素最佳原材料之一。有研究表明同一植物物种内不同栽培品系或种质间褪黑素含量差异巨大,我国是桑树种质资源最丰富的国家,不同桑树种质资源圃收集并保存着大量的种质资源。因此,从大量桑种质资源中筛选出高褪黑素含量的桑品种或种质不但可作为人们日常生活中褪黑素补充合适的植物原料,也能为研究桑树高效褪黑素分子合成机理提供研究材料,具有重要的现实和科学意义。目前为止,为数不多的桑树褪黑素研究报道主要集中在其鉴定和含量测定方面,而桑树种质资源褪黑素及其异构体种类的系统鉴定、含量测定、高含量种质筛选及其生物合成分子机制尚未见报道,极大阻碍了桑树作为高效补充人体褪黑素大众原料的应用及其深度开发和多元利用。综上所述,本研究首先利用UPLC-MS/MS检测技术鉴定不同桑树品种/种质的褪黑素,并对50个不同桑树品种/种质褪黑素含量做定量分析筛选出褪黑素含量最高的桑树品种/种质。其次,利用生物信息学方法,从褪黑素含量最高桑种质—川桑（M.notabilis）全基因组数据库中鉴定出参与褪黑素生物合成相关基因,并开展表达谱分析,筛选参与褪黑素高效合成关键基因并开展体外酶活实验,阐明川桑高效合成褪黑素的分子机制。在桑树褪黑素鉴定实验中意外鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体并对不同品种桑树褪黑素异构体进行了定量分析。为了获得桑叶最佳收获部位和季节,对影响桑树中褪黑素和异构体总含量的非遗传因素也做了初步探究。由于本研究首次在植物组织中鉴定到天然褪黑素异构体,加上有关褪黑素异构体生物合成途径从未见报道过,故选取四个桑树品种不同组织为材料,用UPLC-MS/MS鉴定其不同组织中的褪黑素和异构体。同时利用qRT-PCR分析褪黑素生物合成相关候选基因的表达量,并筛选出可能参与褪黑素异构体生物合成的靶标基因,开展其体外酶活功能的验证分析,拟阐明桑树褪黑素异构体生物合成分子途径,为进一步解析其生物合成分子机理奠定了良好的基础。所获得的结果如下:1.不同桑树品种/种质褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选利用UPLC-MS/MS在鉴定不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量过程中,鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体。在50个不同的桑树品种中,1个桑树品种/种质仅含有褪黑素,42个桑树品种仅含有褪黑素异构体MI-1,而其余7个既含有褪黑素又含有MI-1。为了探究不同桑树品种/种质之间褪黑素含量的差异,分析了50个不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量。结果表明桑树中褪黑素含量为0.26至0.83 ng/g,相差3倍,最高五个桑种质依次是川桑、西农6071、神农架长穗桑、嘉陵16号和嘉陵20号。褪黑素及其异构体的总含量为0.23至20.58ng/g,相差89倍,最高五个桑种质依次是策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、印度桑和甘洛6号。根据测定结果表明川桑、西农6071、神农架长穗桑可作为最佳补充褪黑素的原材料。为了探究环境条件对桑树褪黑素及异构体的影响,利用UPLC-MS/MS检测了不同采摘时间和不同成熟度的桑叶中褪黑素及异构体含量。结果表明褪黑素及其异构体总含量随着采摘时间的先增加后降低,随着叶片成熟度的增加逐渐增加。以上研究结果表明,在6月28日,第20叶位采摘策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、叶片可获得最高褪黑素和异构体含量的桑叶原料。2.川桑（Morus notabilis）褪黑素高效生物合成分子机制解析褪黑素含量最高桑种质为川桑,在川桑基因组数据库中鉴定到37个褪黑素生物合成相关候选基因。以“川桑”为模板成功克隆到37个褪黑素生物合成相关的候选基因,即:一个色氨酸脱羧酶基因（MnTDC）,7个色胺5-羟化酶基因（MnT5H1-7）,6个5-羟色胺N-乙酰基转移酶基因（MnSNAT1-6）基因,20个N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶基因（MnASMT1-20）和3个咖啡酸-氧-甲基转移酶基因COMT（MnCOMT1-3）。生物信息学分析表明桑树中褪黑素合成相关候选基因的结构特征与已经报道的褪黑素生物合成相关基因基本一致。结构域预测和多序列比对分析表明这些蛋白质都具有各蛋白家族催化活性所需的结构域和活性位点。利用qRT-PCR技术研究了褪黑素生物合成相关基因在川桑根、茎、叶和皮中的表达情况,结果表明这些基因在各组织中的表达模式不一,同一家族的不同基因表达量差异较大。MnTDC基因在川桑叶中的表达量是最高的。T5H1和T5H2相比较其他5个T5H基因在根、茎、叶和皮中的表达量较高,T5H7在四个组织多种的表达较低。SNAT1-SNAT5这5个基因的表达模式一致,但SNAT5基因在茎中的表达量是SNAT1的在茎中表达量的20倍。而SNAT6在4个组织中几乎不表达。20个ASMT基因中,ASMT12基因的在根和皮中的表达量是最高的,ASMT3基因在4个组织均不表达,除此之外其他的18个ASMT基因在4个组织中的表达量差异较大。MnCOMT1在茎中的表达最高。构建原核表达载体pCold TF-MnTDC、pCold TF-MnT5H2、pCold TF-MnSNAT5、pCold TF-MnASMT12和pCold TF-MnCOMT1,转入大肠杆菌,分别表达这5个重组蛋白并获得相应可溶的重组蛋白。体外酶活表明MnTDC重组蛋白与底物色氨酸在缓冲液中共孵育鉴定到产物色胺。MnT5H2重组蛋白与底物色胺在缓冲液中共孵育鉴定到产物5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与底物5-羟色胺、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到产物N-乙酰5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与5-甲氧基色氨、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到褪黑素。MnASMT12重组蛋白分别与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnASMT12重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。MnCOMT1重组蛋白与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnCOMT1重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。前人关于ASMT蛋白家族的研究表明,ASMT蛋白家族被分为三个亚家族（I,II,III）,但仅有一个亚家族的成员编码的蛋白表现ASMT蛋白酶的活性。在川桑中MnASMT12属于MnASMT蛋白家族的第I亚族,催化N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素,5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。为了探究MnASMT蛋白家族第II亚家族和第III亚家族成员的功能,我们根据MnASMT各亚家族基因的表达量,选择MnASMT第II亚家族的MnASMT16和第III亚家族的MnASMT20进行进一步研究。将重组的载体pCold TF-MnASMT16和pCold TF-MnASMT20在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,分别获得MnASMT16和MnASMT20重组蛋白。将N-乙酰5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液混合和孵育,用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明MnASMT16和MnASMT20都具有将N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素的能力。此外,将5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液进行共孵育,并使用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明只有MnASMT20重组蛋白将5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。总而言之,酶动力学和体外偶联测定结果表明桑树的褪黑素生物合成不但有多条不同途径,而且所有条途径都能有效地催化色氨酸转化为终产物褪黑素。此外,ASMT基因家族中三个亚家族基因编码的蛋白都有ASMT蛋白酶活性。以上结果表明,川桑可通过多途径、多基因能高效地催化色氨酸向褪黑素转化,可能是其保持丰富褪黑素含量的关键分子机制。3.桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析我们使用相同的桑树品种的不同的组织为实验材料,并利用相同提取和检测方法开展了褪黑素及其异构体的鉴定和定量分析。研究结果表明4个桑树品种褪黑素异构体的种类也有差异。4个桑树品种叶片中都含有褪黑素和两种褪黑素异构体（MI-2和MI-3）,果中仅含有褪黑素和异构体（MI-2）,其中“大十”叶和果中褪黑素及其异构体总含量都是最高的。利用qRT-PCR分析了褪黑素合成相关基因在两个桑树品种“大十”和“白玉皇”的叶、果中的表达情况。结果表明,除MaASMT4和MaASMT20都具有桑叶特异性高表达的模式外,其他参与褪黑素生物合成的基因在两个品种和两个器官的表达模式均不一致。为了进一步确认MaASMT4和MaASMT20两个基因桑叶特异高表达的模式,利用qRT-PCR分析结果表明MaASMT4和MaASMT20在“嘉陵30陵和“中桑5801MT都具有桑叶特异性高表达的模式,这种表达模式与MI-3特异存在叶中的模式一致。因此,将MaASMT4和MaASMT20两个基因作为合成褪黑素异构体MI-3的关键基因进行进一步的分析。以“大十”为模板克隆了MaASMT4和MaASMT20基因并构建原核表达载体pCold TFMaASMT4和pCold TF-MaASMT20,转入大肠杆菌表达其蛋白。外源表达的MaASMT4和MaASMT20重组蛋白体外酶活分析结果表明:属于ASMT基因家族第III亚家族的MaASMT4和MaASMT20在体外都能催化底物N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素异构体MI-3。为了探究MaASMT蛋白家族第I和第II亚家族成员的功能,基于其他两个亚家族不同基因的表达量,以“大十”员为模板克隆了ASMT基因家族第I和第II亚家族的MaASMT9和MaASMT16基因。构建原核表达载体的pCold TF-MaASMT9和pCold TF-MaASMT16转入大肠杆菌表达其重组蛋白。体外酶活结果表明ASMT蛋白家族第I亚家族的MaASMT9和第II亚家族的MaASMT16两个重组蛋白都能催化N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素。这些结果表明褪黑素异构体生物合成分子途径与褪黑素相似,白桑能用特定亚群的ASTM成员实现其体内褪黑素异构体的合成,为进一步植物褪黑素异构体生物合成分子机理解析打下了良好的基础。
刘相培[7]（2021）在《水稻抗铝基因ArPK的克隆及其抗铝机制的研究》文中研究指明铝毒害是酸性土壤中影响植物生长的主要限制因子之一。水稻是禾谷类作物中抗铝毒能力最强的植物,虽然以ART1（Aluminum Resistance Transcription factor1）为核心调控因子的抗铝机制已得到了较为全面的阐述,但是否存在独立于ART1途径的抗铝机制仍有待探索。氮是植物生长必须的大量元素之一,但氮肥长期过量施用会导致土壤酸化,进而提高土壤中铝的活度,引起铝毒害,而氮营养是否会通过体内代谢物影响水稻的抗铝性仍不清楚。为了挖掘新的水稻抗铝基因,我们通过筛选籼稻特青（Oryza sativa indica cv.Teqing）EMS突变体库,获得了一个铝敏感突变体。通过Mut Map基因定位、生理分析、转录组分析和转基因功能验证等方法,明确是一个蛋白激酶的突变导致了铝敏感表型,并发现该激酶直接影响了与氮代谢和铝敏感性密切相关的多胺合成途径。具体结果如下:1.定位于细胞膜及细胞核的激酶蛋白Ar PK突变导致arpk专一对铝敏感从水稻EMS库筛选获得的铝敏感突变体在5μM Al处理下就表现出明显的根伸长抑制表型,但对Cd2+、Zn2+、Cu2+、La3+等重金属离子及不同p H处理的响应与野生型无显着差异,说明该突变对铝毒响应具有专一性。通过基于BSA的Mut Map发现编码一个未知功能的激酶候选基因,将此基因回转入该突变体,铝敏感表型得到很好的回复,说明该基因直接参与了水稻抗铝调控,故将此基因命名为Ar PK（Aluminum related Protein Kinase）。通过GUS染色及基因表达检测,发现此激酶在高铝浓度短时间处理（50μM,3 h）或低浓度长处理时间（20μM,24 h）下显着诱导表达。通过原位免疫荧光染色及烟草瞬时表达实验发现此激酶同时定位于质膜和细胞核。在arpk中调控水稻抗铝性的关键转录因子ART1及其下游抗铝基因的表达与野生型无显着差异,而art1突变体中,Ar PK的表达受铝诱导上调。上述结果表明,Ar PK参与独立于ART1的水稻抗铝性调控途径。2.水稻中NAOGAc T可能补偿NAOD的功能在转录组分析中,发现一个编码乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因（NAOD,N-acetylornithine deacetylase）的表达在arpk突变体中组成型抑制,但用Ca MV35S启动的NAOD转入arpk中后,不能回复突变体的铝敏感表型,表明NAOD转录抑制不是导致突变体arpk对铝敏感的原因。NAOD是鸟氨酸合成线性途径的依赖酶,参与催化N-acetyl-Orn转化为鸟氨酸（Ornithine,Orn）的过程。鉴于部分原核生物与植物中存在鸟氨酸合成的循环途径,通过分析我们发现,突变体arpk中鸟氨酸合成的循环途径中可催化乙酰鸟氨酸通过转乙酰基作用生成Orn的N-乙酰鸟氨酸:谷氨酸转乙酰基酶（N-acetylornithine:glutamate acetyltransferase,NAOGAc T）正常表达,且铝处理可诱导NAOGAc T表达上调。此外,高铵处理可明显缓解突变体arpk铝敏感性,而高铵加铝处理也使得突变体arpk中NAOGAc T比单独铝处理有更高的表达。上述结果表明,水稻中同时存在鸟氨酸合成的线性途径和循环途径,且在一定条件下NAOGAc T可以补偿NAOD的功能。3.突变体arpk中精氨酸代谢中Put合成紊乱影响其抗铝性转录组分析发现,突变体arpk中精氨酸（Arginine,Arg）代谢途径中NAOD催化合成Orn后的下一催化步骤所需鸟氨酸脱羧酶的编码基因ODC1（Ornithine decarboxylase 1）的表达却受铝专一性诱导显着上调,推测Ar PK可能具有抑制ODC1基因表达的功能。ODC催化Orn合成腐胺（Putrescine,Put）,而Put是一种具有多种功能的分子,参与多种植物胁迫响应。分析发现,铝处理后突变体arpk中三种形态的Put（游离态、结合态及束缚态）的含量均明显提高,且均显着高于野生型。有意思的是,添加ODC抑制剂DFMO（Difluoromethylornithine;Eflornithine）可解除突变体arpk中NAOD的转录抑制,且arpk的铝敏感表型得到回复,表明arpk中NAOD的转录抑制可能是对激酶基因Ar PK突变导致其对ODC1抑制解除后的负反馈,而ODC1表达上调引起的Put过量积累是导致arpk对铝敏感的原因。水稻中Put的生物合成还同时存在ADC（Arginine decarboxylase）途径。虽然野生型中ADC2在转录水平对铝响应,但外源添加ADC的抑制剂DFMA后野生型根长仅出现轻微抑制,添加D-Arg（D-Arginine）后野生型根伸长没有变化,由此可见,ADC2在水稻抗铝中可能扮演有限的角色,而稳定调控经ODC途径的多胺合成才是水稻抗铝的基本策略。4.铵通过增加其同化及抑制ODC1转录减少Put合成而提高突变体arpk抗铝性我们进一步分析了高铵处理缓解铝毒的原因,发现高铵加铝处理增加氨同化GS/GOGAT（Glutamine synthetase/Glutamine oxoglutarate aminotransferase）途径及精氨酸合成途径中多数基因的表达,但抑制了多胺合成中ODC1,ADC2及SAMDC1（S-adenosylmethionine decarboxylase 1）等基因的表达。说明在突变体arpk中高浓度的NH4+一方面可能通过抑制突变体arpk中ODC1的转录,降低Put的合成与积累,另一方面可能通过加强NH4+同化而增加胞内氨基酸（Glu,Gln等）及其他与水稻抗铝相关的物质含量以提高其抗铝能力,两方面的共同作用缓解了突变体arpk中的铝毒害。
邹佳男[8]（2020）在《细菌性斑疹病菌分离鉴定及其HrpG突变体诱导大豆抗病基因的挖掘和分析》文中研究说明大豆是我国的重要粮食作物,近年来我国从美国、巴西和阿根廷等国大量进口转基因大豆,数量超过8000万吨,主要用于饲料加工,而国产大豆则主要用于食品加工。黑龙江省是我国最大的大豆种植基地,每年约有6000万亩的种植面积。大豆细菌性病害是目前严重妨碍黑龙江省大豆生产的主要病害。大豆细菌性斑疹病是一种常见于大豆的细菌性病害,会造成大豆产量的严重降低。针对大豆细菌性斑疹病所造成的严重危害,本研究从病原菌的分离鉴定入手,对分离后的病原菌进行致病性鉴定。结合基因组测序技术完成了病原菌的基因组测序和注释。利用含有野生大豆基因组信息的导入系材料对大豆中应答病原菌Ⅲ型效应因子的基因进行了分析。基于大豆重组自交系群体（RIL）接种病原菌后的QTL定位结果,与在导入系上的RNA-seq分析,获得了大豆中应答Ⅲ型效应因子的差异表达基因和节点（hub）基因。进一步利用已测序的种质资源和导入系材料对候选基因进行了单倍型分析,最终确定了大豆中应答病原菌Ⅲ型效应因子的关键候选基因。本研究为深入细致地研究黑龙江省大豆抗细菌性斑疹病的分子机制和大豆的遗传改良奠定了理论基础和材料基础。具体研究结果如下:（1）通过在大田环境下,细菌性病害的发病时期进行大豆叶片病斑的分离和鉴定。确定了8个可以引起大豆细菌性病害的病原菌,其中7个病原菌属于假单胞杆菌菌属,1个属于黄单胞杆菌菌属,通过16S r DNA扩增和测序比对分析,发现该菌株与Xanthomonas vasicola同源性非常高。结合以往的研究基础,一般认为黄单胞杆菌是导致大豆细菌性斑疹病的致病菌。所以本研究将分离得到的黄单胞杆菌作为研究重点进行后续的研究。通过在黑龙江省不同积温带的主栽品种上进行接种鉴定,发现所分离得到的黄单胞杆菌属于高致病性菌株,可以在所选取的黑龙江省主栽大豆品种上造成明显的致病性和大面积的病斑。因为该菌种属于黄单胞杆菌,所以将其命名为Xv NEAU001WT（Xanthomonas vasicola Northeast Agrcultural University Wild Type）。为了后续研究的需要,对Xv NEAU001WT的抗生素抗性进行了分析。结果表明Xv NEAU001WT具有壮观霉素抗性,而不具有对利福平、卡那霉素、氯霉素、庆大霉素和四环素等抗生素的抗性。该结果为利用壮观霉素对Xv NEAU001WT进行抗性保护以保证在菌种的培养、保存和遗传改造操作过程中不受其它杂菌的污染提供了保障。（2）在完成Xv NEAU001WT的分离鉴定和抗性分析后,本研究进一步针对Xv NEAU001WT的基因组信息进行了测序分析。为获得Xv NEAU001WT的基因组原始序列,以二代测序技术为手段进行测序,最终完成了Xv NEAU001WT的基因组序列测定和序列所编码的基因注释和结构分析。将以往已公布的黄单胞杆菌的基因组作为参考进行基因组的组装拼接,最终将Xv NEAU001WT基因组的序列拼接成一个大质粒,该质粒共有5221943 bp,并将序列信息上传到NCBI数据库。通过基因组注释分析发现该菌株可以编码15个Ⅲ型效应因子相关的hrp基因。前人研究发现hrp基因是影响黄单胞杆菌致病性的关键基因,所以本研究针对hrp基因的调控基因hrp G开展深入研究。采用三亲杂交的方式构建了hrp G基因的缺失突变体。进一步在大豆种质资源绥农14上进行了致病性分析,发现hrp G基因突变后可以显着影响Xv NEAU001WT的致病性。此结果说明大豆中存在响应hrp G调控的Ⅲ型效应因子的抗病相关基因。（3）为了进一步鉴定分析大豆中应答hrp调控的Ⅲ型效应因子的关键基因,本研究采用了RNA-seq测序和QTL定位相结合的方法。以含有野生大豆基因组信息的代换系群体和高世代的重组自交系群体为大豆材料,以野生型的Xv NEAU001WT和hrp G突变后的Xv NEAU001WT△hrp G为菌种材料,进行差异基因的分析和QTL定位分析,为寻找抗病关键候选基因提供可靠信息。在导入系中通过接种野生型病原菌Xv NEAU001WT,发现导入系材料F1680和F1011在抗感病表型上与导入系轮回亲本绥农14存在明显的差异。其中F1680表现为更加感病,F1011表现为更加抗病。这一结果说明野生大豆基因组的导入导致了大豆抗病性的改变,同时也说明导入片段中含有调控大豆抗病性的关键基因。于是,首先对F1011和F1680的遗传背景进行分析,确定导入片段所在的位置,然后利用绥农14、F1011和F1680进行RNA-seq分析,通过3个时间点81个样本的取样,对大豆接种病原菌后的6 h、12 h、24 h进行了分析,获得了4624个差异表达基因。发现4个基因组块C4、C5、C6和C8中的基因显着与F1011和F1680的抗感性相关。进一步通过基因共表达网络分析,获得了35个节点（hub）基因。这些hub基因分布在01-17以及19号染色体上。通过结合QTL的定位结果,在08和11号染色体上确定了受hrp G编码的Ⅲ型效应因子调控基因诱导的关键基因2个,分别为Glyma.08G009900.1和Glyma.11G056200.1。（4）为了确定两个候选基因（Glyma.08G009900.1和Glyma.11G056200.1）的准确性,进一步对200份导入系群体中两个基因的遗传多样性进行了分析。通过与绥农14的遗传背景进行比对分析,发现在Glyma.08G009900.1和Glyma.11G056200.1存在显着的单倍型,并且单倍型在F1011和F1680间存在显着的差异,与2份材料的抗病性存在一致性的顺应关系。进而更加证明了这两个基因是大豆中响应hrp G调控的Ⅲ型效应因子响应基因。基于以上研究结果,说明通过本研究得到的2个关键基因Glyma.08G009900.1和Glyma.11G056200.1可以作为重要的抗病候选基因进行深入的机理研究。同时本研究所采用的材料和理念,为深入细致的研究大豆抗细菌性斑疹病提供了重要的理论基础和材料基础。同时所发现的QTL和遗传多样性可以进一步作为标记开发理论基础。研究结果对保证黑龙江省大豆的稳产高产具有重要的理论意义和应用价值。
王昊云[9]（2021）在《长雄蕊野生稻白化苗、落粒性和剑叶长度的遗传分析》文中研究表明随着全球人口的增长,人类对粮食的需求也在不断增加,进一步提高作物的产量是解决这一难题的有效方法。水稻是重要的粮食作物,也是单子叶植物研究过程中的模式生物。长雄蕊野生稻（Oryza longistaminata,长野）是优良的水稻种质资源,跟栽培稻（Oryza sativa）同属于AA基因组。叶色、穗部性状和叶型在内的许多因素都会对水稻产量产生巨大影响。定位导致水稻白化的基因,有助于探究水稻叶绿体发育及光合作用的机理。而定位落粒性的基因有利于探究作物的起源和驯化,同时避免在开发利用长雄蕊野生稻的优良性状时因落粒造成产量上的损失。禾本科作物中最后的一片功能叶被称为剑叶。剑叶是禾本科作物进行光合作用的主要部位,是水稻灌浆期的高效功能叶。探明水稻长剑叶性状的遗传机理,能为改良水稻剑叶形态提供参考依据。本试验以长雄蕊野生稻为父本,粳稻Balilla为母本杂交构建的F2群体为研究材料。利用全基因组In Del分子标记对F2群体进行基因型检测,然后通过QTL分析软件构建遗传连锁图谱并结合表型对白化苗、落粒性、剑叶长度性状分别进行遗传分析,结果如下:1、长雄蕊野生稻和F2群体中存在着白化苗和正常绿苗两种表型,结合F2群体基因型和表型数据,对导致水稻苗期白化的基因位点进行了初步定位。利用R/qtl软件定位到1个位点q AL-1-1;利用Ici Mapping4.0软件定位到2个QTL位点q AL-1-2和q AL-1-3。结合BSA（Bulked Segregant Analysis,分离群体分组混合分析法）分析,确定q AL-1-1是导致水稻苗期白化致死的位点。对F2群体白化苗和绿苗的q AL-1-1基因型进行分析,发现导致白化的等位基因来自于长雄蕊野生稻,其纯合基因型为白化表型,杂合基因型和Balilla纯合基因型为正常绿苗表型,说明q AL-1-1是导致水稻白化的关键位点。2、长雄蕊野生稻和Balilla在落粒性表型上存在差异;长雄蕊野生稻平均抽穗30天后完全落粒,而Balilla不落粒。结合两季F2群体的落粒性数据,利用R/qtl软件定位到了6个QTL位点,Ici Mapping4.0软件定位到4个QTL位点。其中q SH-3-1、q SH-4-1、q SH-8-1、q SH-12-1在两个软件中都被检测到。在Ici Mapping4.0软件中,q SH-3-1、q SH-4-1、q SH-8-1分别能解释8.09%、6.37%、50.63%的表型变异。q SH-12-1在2019年早稻和晚稻分别解释6.84%、4.95%的表型变异。其中q SH-8-1效应最大,可能是一个主效位点。3、利用2018年早稻和晚稻的F2群体,对剑叶长度性状进行QTL定位。R/qtl和Ici Mapping4.0软件都检测到7个QTL位点。其中q FL-6-1、q FL-7-1、q FL-8-1、q FL-9-1在两个软件中都检测到,分别能解释8.08%、8.47%、22.00%、23.00%的表型变异。R/qtl软件检测时发现,q FL-9-1在两季检测结果中重复出现,可能是控制水稻剑叶长度的一个主效位点。通过与已发表的QTL比较,未发现有关q FL-2-1、q FL-8-2的报道,其可能是2个新的QTL。同一F2群体两季表型之间存在显着差异,说明环境对剑叶长度影响较大。在前人研究基础上进行回交,分析BC4F3群体数据,发现q FLL-9-1的基因型和表型还未共分离,但不同基因型之间的表型平均值仍具有一定差异,推测该主效位点可能还需要其他位点的辅助才能表现出效应。在F2群体中,导致水稻苗期白化、落粒性增强的等位基因来自长雄蕊野生稻;而对于剑叶长度表型,q FL-6-1、q FL-7-1的增效等位基因来自于母本Balilla,q FL-8-1、q FL-9-1的增效等位基因来自于父本长雄蕊野生稻。落粒性和剑叶长度的性状都是由多基因控制。
李超[10]（2021）在《水稻温敏核雄性不育系育性转换机理及OsLHY基因调控光周期开花的功能研究》文中研究表明水稻不仅是主要粮食作物之一,还是研究单子叶植物功能基因组的模式植物。水稻光温敏核雄性不育（Photoperiod-or Thermos-sensitive Genic Male Sterility,P/TGMS）系是两系杂交水稻育种的关键,杂交水稻为世界粮食安全做出了突出的贡献。因此,研究P/TGMS系不育分子机理具有重要的理论意义和实用价值。到目前为止,已定位了一系列控制水稻P/TGMS的不育基因,并克隆了其中少数不育基因,但对于P/TGMS育性转换的分子机制仍然鲜有研究。浙大13S（Zheda13S）是本实验室培育的水稻新TGMS材料。本研究通过对Zheda13S幼穗在不同温度条件下转录组分析,挖掘出许多与育性转换相关的候选基因。其中包括一个生物钟基因OsLHY,与PT（Permissive temperature）条件相比,在RT（Restrictive temperature）条件下OsLHY在Zheda13S的小孢子母细胞时期（Microspore Mother Cell stage,MMC）和减数分裂时期（Meiosis stage,MEI）幼穗中表达量下降。随后利用CRISPR/Cas9基因编辑、转基因以及分子生物学等方法和技术对OsLHY功能进行系统分析。主要研究结果如下:1.利用RNA-Seq技术比较了Zheda13S在R/PT下MMC和MEI幼穗的表达谱。在这两个时期,共鉴定到1070个差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）,其中上调表达的基因有398个,下调表达的基因有672个。GO和KEGG富集分析表明,DEGs主要富集在蛋白质折叠、蛋白质结合、转录调控、转录因子活性和代谢相关过程中。此外,蛋白质-蛋白质互作网络预测以及网络拓扑分析表明,UbL40s、DNA介导的RNA聚合酶亚基基因、热激蛋白基因（HSPs）和激酶（Kinases）基因是互作网络的核心基因（hub gene）,而UbL40s与蛋白水解代谢相关基因、DNA介导的RNA聚合酶亚基基因间的相互作用以及HSPs与Kinases间的相互作用,在调控育性转换中发挥重要作用。表明,除UbL40s外,DNA介导的RNA聚合酶亚基基因、Kinases和HSPs可能也参与了水稻TGMS系的育性转换过程。2.与PT条件相比,在RT条件下生物钟基因OsLHY在Zheda13S的MMC和MEI幼穗中表达量下降。利用CRISPR/Cas9编辑技术共获得9个T0代oslhy突变体。在长日照条件下,oslhy突变体延迟水稻抽穗期,但对育性并没有直接影响。分析OsLHY在不同组织中表达模式结果显示,OsLHY在叶片中表达量最高。亚细胞定位结果表明OsLHY是一个核定位蛋白。生物钟基因的昼夜节律分析表明,它们的表达在oslhy突变体中都发生了改变。其中OsELF3是长日照条件下的开花促进基因,在oslhy突变体中夜间表达水平降低。进一步研究表明,在oslhy突变体中,长日照条件下的开花抑制基因Hd1和Ghd7表达上调,开花促进基因Ehd1、Hd3a和RFT1的表达下调。双荧光素酶实验结果显示OsLHY能抑制OsGI、Hd1、Ghd7、Hd3a、RFT1和OsELF3的转录,激活Ehd1的转录。此外,酵母单杂实验证实OsLHY能直接与OsGI、RFT1和OsELF3的启动子结合,这与拟南芥中的结果一致。这些结果表明OsLHY在长日照条件下主要通过Hd1和Ehd1介导的光周期开花途径调控水稻开花。综上所述,本研究通过比较水稻TGMS系幼穗在R/PT条件下转录组的差异,挖掘了一系列的差异表达基因,可能参与水稻TGMS系的育性转换过程。此外,对其中的差异表达基因OsLHY的功能进行了系统分析,发现OsLHY是长日照条件下开花促进因子。并进一步探究了OsLHY是如何调控水稻的抽穗期。这些研究结果为系统阐明水稻TGMS系的育性转换分子机理提供新的视角和基础。同时,丰富了对水稻生物钟与抽穗期调控网络的认识,为人工调控水稻花期提供新的材料和理论依据,同时为进一步研究生物钟基因LHY的功能提供了重要参考。
二、Isolation and genetic charac-terization of a fragile plant mutant in rice (Oryza sativa L.)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Isolation and genetic charac-terization of a fragile plant mutant in rice (Oryza sativa L.)（论文提纲范文）
（1）水稻雌雄不育突变体Osfma2的细胞学观察及基因图位克隆（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 I2-KI染色观察花粉育性 |
| 1.3 曙红染色法观察胚囊的发育过程 |
| 1.4 醋酸洋红染色观察花粉发育过程 |
| 1.5 花药半薄切片观察雄配子发育过程 |
| 1.6 DAPI染色观察雄配子孢原细胞染色体的扩散 |
| 1.7 水稻不育基因的定位与克隆 |
| 1.8 荧光定量检测基因表达量 |
| 1.9 水稻原生质体分离及亚细胞定位 |
| 1.1 0 进化树分析及同源序列比对 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Osfma2突变体表型鉴定 |
| 2.2 野生型和突变体Osfma2的花粉发育过程 |
| 2.3 野生型和突变体Osfma2的花药半薄切片 |
| 2.4 雄性孢母细胞的染色体分离异常 |
| 2.5 突变体Osfma2胚囊发育受阻 |
| 2.6 突变体Osfma2的遗传分析 |
| 2.7 OsFMA2基因定位与克隆 |
| 2.8 突变位点的测序验证 |
| 2.9 蛋白Os FMA2同源序列比对及进化树分析 |
| 2.1 0 Os FMA2基因的组织表达模式 |
| 2.11亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
（2）亚麻荠WRKY转录因子家族的鉴定及其介导盐胁迫响应的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 特色油料作物亚麻荠 |
| 1.1.1 亚麻荠抗逆性及优异农艺性状 |
| 1.1.2 亚麻荠的广泛应用 |
| 1.2 盐胁迫对植物生长发育的影响及植物对盐胁迫的应答 |
| 1.3 参与植物胁迫响应的转录因子 |
| 1.4 WRKY转录因子与植物生长发育及胁迫响应的调控 |
| 1.4.1 WRKY转录因子的特征 |
| 1.4.2 参与植物胁迫响应的WRKY转录因子研究进展 |
| 1.5 本研究的目的、意义及主要内容 |
| 1.6 本研究的技术路线 |
| 第二章 亚麻荠对盐胁迫响应的生理生化表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 营养液配方 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 亚麻荠幼苗的处理 |
| 2.3.2 植株形态指标测定 |
| 2.3.3 植株生理指标测定 |
| 2.3.4 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 盐胁迫对亚麻荠幼苗生长的影响 |
| 2.4.2 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片光合作用的影响 |
| 2.4.3 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片渗透调节物质的影响 |
| 2.4.4 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片丙二醛含量和相对电导率的影响 |
| 2.4.5 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片抗坏血酸和H_2O_2的影响 |
| 2.4.6 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片抗氧化体系的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 亚麻荠幼苗转录组分析与盐胁迫响应转录因子的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 亚麻荠转录组测序 |
| 3.3.2 亚麻荠测序数据分析 |
| 3.3.3 差异表达基因筛选与及功能富集分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 测序数据质量分析 |
| 3.4.2 亚麻荠差异表达基因的分析 |
| 3.4.3 差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.4.4 差异表达基因的KEGG富集分析 |
| 3.4.5 介导亚麻荠盐胁迫响应的候选转录因子分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 参与盐胁迫响应的基因及代谢通路 |
| 3.5.2 转录因子介导植物盐胁迫响应 |
| 3.5.3 WRKY转录因子是调控植物盐胁迫应答的重要成员 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 亚麻荠WRKY转录因子的全基因组鉴定与盐胁迫响应CsWRKY的筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 亚麻荠WRKY转录因子的筛选 |
| 4.3.2 亚麻荠WRKY转录因子的理化性质分析 |
| 4.3.3 亚麻荠WRKY转录因子保守结构域和基因结构及进化分析 |
| 4.3.4 亚麻荠WRKY基因在不同组织器官表达谱和盐胁迫表达分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 全基因组鉴定获得242 个亚麻荠CsWRKY家族成员 |
| 4.4.2 15个CsWRKY基因位点可变剪接产生33 个不同的ORF剪接体 |
| 4.4.3 亚麻荠CsWRKY蛋白多序列比对和进化树分析 |
| 4.4.4 CsWRKY蛋白检测到10 个保守基序 |
| 4.4.5 亚麻荠CsWRKY基因不均匀地分布于各染色体 |
| 4.4.6 亚麻荠CsWRKY基因家族扩增的进化驱动力及CsWRKY和拟南芥、油菜WRKY的共线性分析 |
| 4.4.7 CsWRKY基因在不同组织中的表达 |
| 4.4.8 CsWRKY基因在盐胁迫下亚麻荠幼苗的表达谱 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 亚麻荠WRKY成员的保守性和差异性 |
| 4.5.2 基因片段复制构成亚麻荠WRKY家族急剧扩增的关键进化动力 |
| 4.5.3 部分CsWRKYs可能是介导亚麻荠盐胁迫响应的核心转录因子 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 应用莱茵衣藻遗传转化体系鉴定亚麻荠CsWRKY9、43和162 基因的功能 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 试验试剂 |
| 5.2.3 菌株与载体 |
| 5.2.4 培养基的配制 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 亚麻荠CsWRKY9、43和162 基因的克隆和分析 |
| 5.3.2 构建CsWRKY9、43和162 基因的表达载体 |
| 5.3.3 CsWRKY9、43和162 基因的莱茵衣藻遗传转化 |
| 5.3.4 CsWRKY9、43和162 转基因藻株的筛选与鉴定 |
| 5.3.5 CsWRKY9、43和162 转化藻株的生理指标测定 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 亚麻荠CsWRKY9、43和162 基因的克隆及编码蛋白特性分析 |
| 5.4.2 CsWRKY9、43和162 基因表达载体的鉴定 |
| 5.4.3 阳性转化藻株的筛选及基因组DNA PCR鉴定 |
| 5.4.4 转化藻株目的基因CsWRKY9、43和162 表达分析 |
| 5.4.5 转化藻株CsWRKY9、43和162 对盐胁迫响应的表征 |
| 5.4.6 莱茵衣藻内源 CrWRKY敲除株系与过表达外源 CsWRKY藻株盐胁迫响应的表型比较 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 亚麻荠CsWRKY162 过表达及CRISPR/Cas9 敲除突变体的构建和表型分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 植物材料 |
| 6.2.2 试验试剂 |
| 6.2.3 菌种与载体 |
| 6.2.4 培养基的配制 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 构建CsWRKY162 基因的过表达载体 |
| 6.3.2 构建CRISPR/Cas9 敲除载体 |
| 6.3.3 亚麻荠的遗传转化 |
| 6.3.4 转基因亚麻荠的鉴定及盐胁迫处理 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 CsWRKY162 植物过表达载体的鉴定 |
| 6.4.2 CsWRKY162 CRISPR/Cas9 敲除载体的鉴定 |
| 6.4.3 亚麻荠最适Hyg筛选浓度的确定 |
| 6.4.4 亚麻荠CsWRKY162 基因过表达株系的筛选及PCR鉴定 |
| 6.4.5 亚麻荠CsWRKY162 基因过表达株系对盐胁迫响应的表征 |
| 6.4.6 过表达株系中胁迫相关基因的表达 |
| 6.4.7 亚麻荠CsWRKY162 基因敲除株系的筛选及基因组DNA PCR鉴定 |
| 6.4.8 亚麻荠CsWRKY162 基因敲除株系响应盐胁迫的表征 |
| 6.4.9 CsWRKY162 敲除株系中胁迫相关基因的表达 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 全文总结及展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录 |
| 附表 |
| 附图 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）多组学分析揭示转录和表观遗传变化对于水稻适应缺铁环境的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物缺铁应答研究进展 |
| 1.1.1 植物铁吸收分子机制 |
| 1.1.2 植物缺铁响应基因的调控 |
| 1.2 植物DNA甲基化研究进展 |
| 1.2.1 从头合成甲基化(De novo methylation) |
| 1.2.2 DNA甲基化模式的维持 |
| 1.2.3 植物DNA去甲基化 |
| 1.2.4 RdDM在转座子沉默和基因表达调控中的作用 |
| 1.2.5 DNA甲基化在植物应对非生物胁迫中的研究进展 |
| 1.3 植物非编码RNA研究进展 |
| 1.3.1 植物长非编码RNA(lncRNA)研究进展 |
| 1.3.2 植物miRNA研究进展 |
| 1.3.3 植物lncRNA与sRNA互作关系 |
| 2 DNA甲基化参与水稻适应缺铁环境的机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料及培养条件 |
| 2.1.2 水稻叶片SPAD值及铁含量测定 |
| 2.1.3 全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS) |
| 2.1.4 甲基化测序数据处理及分析 |
| 2.1.5 RNA提取和RNAseq建库测序 |
| 2.1.6 mRNA-seq测序数据处理及分析 |
| 2.1.7 实时荧光定量PCR |
| 2.1.8 亚硫酸氢盐测序分析 |
| 2.1.9 “Dong Jin”背景野生型和突变体osdrm2的获得和鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 缺铁对水稻全基因组DNA甲基化的影响 |
| 2.2.1.1 水稻全基因组重亚硫酸盐测序质量评估 |
| 2.2.1.2 缺铁对水稻全基因组DNA甲基化水平及分布模式影响 |
| 2.2.1.4 缺铁诱导转录水平变化分析 |
| 2.2.1.5 DNA甲基化水平变化对基因表达的影响 |
| 2.2.1.6 去甲基化对水稻适应缺铁环境的影响 |
| 2.2.1.7 DNA甲基化相关酶及RdDM通路基因受缺铁诱导情况 |
| 2.3 小结和讨论 |
| 3 缺铁响应siRNA及miRNA的鉴定与分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料及培养条件 |
| 3.1.2 小RNA测序和降解组测序 |
| 3.1.3 小RNA测序数据处理及分析 |
| 3.1.4 降解组测序数据处理及分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 siRNA簇调控DNA甲基化参与缺铁响应 |
| 3.2.2 缺铁响应miRNA鉴定 |
| 3.3 小结和讨论 |
| 4 缺铁响应长链非编码(lncRNA)的鉴定与分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料及培养条件 |
| 4.1.2 链特异性RNA建库测序 |
| 4.1.3 链特异性RNA测序数据处理及分析 |
| 4.1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 缺铁响应lncRNA鉴定 |
| 4.2.2 lncRNA作为内源性靶标与miRNA参与铁稳态 |
| 4.2.3 差异表达lncRNA与mRNA互作分析 |
| 4.2.4 bHLH156和IRO2下游缺铁响应lncRNA分析 |
| 4.3 小结和讨论 |
| 5 全文总结 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 7.1 大豆种子早期发育过程时空转录组分析 |
| 主要结果 |
| 7.2 烟草打顶前后mRNA和非编码RNA表达特征研究 |
| 8 攻读博士期间的科研成果 |
（4）水稻花期耐热性与耐热QTL定位及候选基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 花期高温胁迫对水稻生长发育的影响 |
| 1.1.1 花期高温危害临界温度 |
| 1.1.2 高温胁迫对花器官(颖花育性)的影响 |
| 1.1.3 高温胁迫对水稻生理过程的影响 |
| 1.1.4 高温胁迫对花后水稻产量和品质的影响 |
| 1.2 水稻高温胁迫应对措施 |
| 1.2.1 农艺措施 |
| 1.2.2 育种策略 |
| 1.2.3 生物技术策略 |
| 1.3 水稻品种花期耐热性鉴定与评价 |
| 1.3.1 水稻品种耐热型分类 |
| 1.3.2 水稻品种耐热性遗传改良 |
| 1.3.3 水稻品种耐热性鉴定与评价 |
| 1.4 水稻耐热性的遗传基础 |
| 1.4.1 水稻耐热性QTL定位 |
| 1.4.2 水稻耐热性基因克隆 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 水稻花期耐热性鉴定方法研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 试验设计 |
| 2.1.3 测定指标与方法 |
| 2.1.4 数据分析与处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同高温处理条件下水稻的颖花结实率表现 |
| 2.2.2 高温危害临界温度(T_t)和高温危害积温(T_a) |
| 2.2.3 高温危害积温与水稻颖花相对结实率的关系 |
| 2.3 小结 |
| 3 不同水稻基因型花期耐热性鉴定与评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 试验设计 |
| 3.1.3 测定指标与方法 |
| 3.1.4 数据分析与处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同水稻基因型花期高温胁迫下结实率表现 |
| 3.2.2 不同水稻基因型花期耐热性鉴定 |
| 3.2.3 不同水稻品种聚类分析 |
| 3.2.4 相对结实率与产量的相对隶属值二维象限分布特征 |
| 3.3 小结 |
| 4 不同水稻基因型花期耐热性的生理特征 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试材料 |
| 4.1.2 试验设计 |
| 4.1.3 测定指标与方法 |
| 4.1.4 数据分析与处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 高温处理条件下不同水稻品种颖花育性的影响 |
| 4.2.2 高温胁迫对不同水稻品种Pn和 SPAD值的影响 |
| 4.2.3 高温胁迫对不同水稻品种NSC、可溶性蛋白、脯氨酸和MAD含量的影响 |
| 4.2.4 高温胁迫对不同水稻品种抗氧化酶活性的影响 |
| 4.3 小结 |
| 5 水稻花期耐热QTL定位及候选基因分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试材料 |
| 5.1.2 水稻花期耐热性鉴定 |
| 5.1.3 BSA-seq分析 |
| 5.1.3.1 高、低基因池构建 |
| 5.1.3.2 重测序分析 |
| 5.1.4 候选基因qRT-PCR分析 |
| 5.1.5 同源基因分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 F_(2:3)群体耐热性表型鉴定 |
| 5.2.2 基于BSA-seq的水稻花期耐热基因定位 |
| 5.2.2.1 亲本及高低混池全基因组测序 |
| 5.2.2.2 基于BSA-seq的水稻耐热QTL定位 |
| 5.2.3 qHTT8 区间耐热候选基因分析 |
| 5.2.4 qHTT8 区间耐热候选基因qRT-PCR分析 |
| 5.2.5 qHTT8 的系统发育分析 |
| 5.3 小结 |
| 6 结论与讨论 |
| 6.1 结论 |
| 6.1.1 水稻花期耐热性鉴定方法研究 |
| 6.1.2 不同水稻基因型花期耐热性鉴定与评价 |
| 6.1.3 水稻花期耐热生理基础 |
| 6.1.4 水稻花期耐热性QTL定位及候选基因分析 |
| 6.2 讨论 |
| 6.2.1 水稻花期耐热性鉴定与评价 |
| 6.2.2 水稻花期耐热生理机制 |
| 6.2.3 水稻花期耐热QTL定位 |
| 6.3 主要创新点及不足之处 |
| 6.3.1 基于高温危害积温与相对结实率关系建立水稻花期耐热性鉴定新方法 |
| 6.3.2 鉴定筛选出不同耐热性水稻品种/材料 |
| 6.3.3 采用农艺性状好的水稻品种为亲本,利用BSA分析方法,挖掘到了1 个与水稻花期耐热性相关的QTL及2 个候选基因 |
| 6.3.4 不足之处 |
| 6.4 未来展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间科研及论文发表情况 |
（5）水稻类病斑基因LML11的图位克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物类病斑突变体的发生方式 |
| 1.2 植物类病斑突变体的特征与分类 |
| 1.3 植物类病斑突变体的发生机制 |
| 1.4 植物类病斑基因参与的防御信号通路 |
| 1.4.1 活性氧信号通路 |
| 1.4.2 水杨酸信号通路 |
| 1.4.3 茉莉酸和乙烯信号通路 |
| 1.4.4 脱落酸信号通路 |
| 1.4.5 R基因信号通路 |
| 1.4.6 一氧化氮信号通路 |
| 1.5 水稻类病斑突变体基因的克隆 |
| 第二章 水稻类病斑基因LML11 的图位克隆与功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 生化试剂与仪器 |
| 2.3 方法与步骤 |
| 2.3.1 突变体的农艺性状调查 |
| 2.3.2 叶绿素含量测定 |
| 2.3.3 光合速率的测定 |
| 2.3.4 生理生化实验分析 |
| 2.3.5 H_2O_2、CAT和 MDA的测定 |
| 2.3.6 遮光和黑暗处理实验 |
| 2.3.7 叶绿体透射电镜观察及种子胚乳扫描电镜观察 |
| 2.3.8 蛋白提取和Western blot分析 |
| 2.3.9 灌浆速率调查 |
| 2.3.10 稻米品质测定 |
| 2.3.11 GA处理种子发芽分析 |
| 2.3.12 LML11 的图位克隆 |
| 2.3.13 植物总RNA的提取、反转录和qRT-PCR反应 |
| 2.3.14 主要载体的构建 |
| 2.3.15 水稻的遗传转化 |
| 2.3.16 水稻原生质体的提取和转化 |
| 2.3.17 白叶枯病抗性鉴定 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 lml11 突变体的表型分析与农艺性状 |
| 2.4.2 lml11 突变体的叶绿素含量与叶绿体结构分析 |
| 2.4.3 lml11 突变体光合速率的测定 |
| 2.4.4 lml11 突变体的活性氧积累分析 |
| 2.4.5 lml11 突变体的PCD分析 |
| 2.4.6 lml11 突变体的遮光处理与离体黑暗处理分析 |
| 2.4.7 lml11 突变体的灌浆速率调查与拷种分析 |
| 2.4.8 lml11 突变体的稻米品质分析 |
| 2.4.9 lml11 突变体的种子GA处理分析 |
| 2.4.10 lml11 突变体的遗传分析与LML11 的图位克隆 |
| 2.4.11 LML11 的转基因验证 |
| 2.4.12 LML11 的生物信息学分析 |
| 2.4.13 LML11 的基因表达分析 |
| 2.4.14 LML11 的亚细胞定位分析 |
| 2.4.15 lml11 突变体的抗病性分析与病程相关基因的表达 |
| 2.4.16 lml11 突变体的转录组测序分析 |
| 2.5 结论与讨论 |
| 2.5.1 类病斑的产生影响了lml11 突变体的农艺性状 |
| 2.5.2 类病斑的产生影响了lml11 突变体的生理生化特征 |
| 2.5.3 lml11 突变体的类病斑表型是黑暗诱导的 |
| 2.5.4 类病斑的产生影响了lml11 突变体的灌浆速率和稻米品质 |
| 2.5.5 LML11 基因的突变影响了种子的发芽 |
| 2.5.6 LML11 蛋白属于GRDP家族蛋白 |
| 2.5.7 LML11 属于组成型表达基因 |
| 2.5.8 lml11 突变体对白叶枯病菌的抗性增强 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 褪黑素及异构体的概述 |
| 1.1.1 褪黑素的概述 |
| 1.1.2 褪黑素异构体的概述 |
| 1.2 褪黑素及异构体的分布 |
| 1.2.1 褪黑素的分布 |
| 1.2.2 褪黑素异构体的分布 |
| 1.3 褪黑素及异构体的生理功能 |
| 1.3.1 褪黑素在动物体中的功能 |
| 1.3.2 褪黑素在植物中中的功能 |
| 1.3.3 褪黑素异构体的功能 |
| 1.4 植物褪黑素及异构体的生物合成 |
| 1.4.1 褪黑素生物合成路径 |
| 1.4.2 色氨酸脱羧酶(TDC) |
| 1.4.3 色胺5-羟化酶(T5H) |
| 1.4.4 5-羟色胺N-乙酰基转移酶(SNAT) |
| 1.4.5 N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶(ASMT) |
| 1.4.6 咖啡酸-氧-甲基转移酶(COMT) |
| 1.5 桑树中褪黑素研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 不同桑树品种/种质褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选 |
| 2.2.2 川桑褪黑素高效生物合成分子机制解析 |
| 2.2.3 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析 |
| 2.3 研究路线 |
| 第三章 不同桑树品种褪黑素及异构体的鉴定和定量分析 |
| 3.1 材料的数据 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 3.1.3 主要使用仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同桑树品种资源中褪黑素检测与鉴定 |
| 3.2.2 不同桑树品种资源褪黑素及其异构体总含量变化 |
| 3.2.3 不同采摘季节的桑叶褪黑素及其异构体含量变化 |
| 3.2.4 不同发育程度的桑叶褪黑素及其异构体含量变化 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 3.3.1 本章讨论 |
| 3.3.2 本章小结 |
| 第四章 川桑褪黑素生物合成相关基因的鉴定、克隆与生物信息学分析 |
| 4.1 材料及主要试剂 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 4.1.3 主要使用仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 桑树褪黑素生物合成相关基因的鉴定 |
| 4.2.2 RNA提取及质量检测 |
| 4.2.3 川桑褪黑素生物合成相关基因的克隆 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 川桑中褪黑素生物合成相关基因的的序列鉴定 |
| 4.3.2 MnTDC基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.3 MnT5H基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.4 MnSNAT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.5 MnASMT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.6 MnCOMT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 本章讨论 |
| 4.4.2 本章小结 |
| 第五章 川桑褪黑素生物合成相关基因表达分析和亚细胞定位 |
| 5.1 材料及主要试剂 |
| 5.1.1 生物材料 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 5.1.3 主要使用仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实时荧光定量PCR检测褪黑素合成相关基因在川桑不同组织的表达量 |
| 5.2.2 亚细胞定位引物设计及载体的选择 |
| 5.2.3 亚细胞定位载体的构建 |
| 5.2.4 亚细胞定位载体转化农杆菌 |
| 5.2.5 褪黑素生物合成相关基因的亚细胞定位 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 川桑褪黑素生物合成相关基因在不同组织表达分析 |
| 5.3.2 川桑褪黑素生物合成相关基因的亚细胞定位 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 本章讨论 |
| 5.4.2 本章小结 |
| 第六章 川桑褪黑素生物合成机制研究 |
| 6.1 材料及主要试剂 |
| 6.1.1 生物材料 |
| 6.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 6.1.3 主要使用仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 原核表达载体的构建 |
| 6.2.2 纯化靶标蛋白 |
| 6.2.3 靶标蛋白酶活测定 |
| 6.2.4 影响酶活因素 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 MnTDC重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.2 MnT5H2重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.3 MnSNAT5重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.4 MnASMTs重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.5 MnCOMT1重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 本章讨论 |
| 6.4.2 本章小结 |
| 第七章 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析 |
| 7.1 材料及主要试剂 |
| 7.1.1 生物材料 |
| 7.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 7.1.3 主要使用仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 RNA提取及质量检测 |
| 7.2.2 实时荧光定量PCR检测褪黑素合成相关基因在桑树不同组织的表达量 |
| 7.2.3 桑树MaASMT4、MaASMT9、MaASMT16和MaASMT20基因的克隆 |
| 7.2.4 原核表达载体的构建 |
| 7.2.5 纯化靶标蛋白 |
| 7.2.6 靶标蛋白酶活测定 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 桑树不同组织中褪黑素和异构体的检测与鉴定 |
| 7.3.2 褪黑素生物合成相关基因在桑树组织特异性表达分析 |
| 7.3.3 MaASMT4和MaASMT20在桑树中克隆分析 |
| 7.3.4 MaASMTs重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 7.4 讨论与小结 |
| 7.4.1 本章讨论 |
| 7.4.2 本章小结 |
| 第八章 全文总结 |
| 8.1 不同桑树品种褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选 |
| 8.2 川桑褪黑素高效生物合成分子机制 |
| 8.3 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的文章及参研的课题 |
| 致谢 |
（7）水稻抗铝基因ArPK的克隆及其抗铝机制的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物铝毒害及抗铝机制的研究 |
| 1.1.1 铝毒害的发生与主要表现 |
| 1.1.2 植物抗铝的外部排斥机制 |
| 1.1.3 植物抗铝的内部忍耐机制 |
| 1.1.4 典型抗铝植物的抗铝机制概述 |
| 1.2 精氨酸代谢及其分解去路中多胺的代谢 |
| 1.2.1 精氨酸代谢 |
| 1.2.2 多胺的代谢及调控 |
| 1.2.3 多胺在植物适应逆境胁迫中的作用 |
| 1.3 矿质元素对植物铝毒害的影响 |
| 1.3.1 铵与铝的互作 |
| 1.3.2 磷与铝的互作 |
| 1.3.3 镁与铝的互作 |
| 1.3.4 微量元素硼、硅等与铝的互作 |
| 1.4 研究目的及技术路线 |
| 第二章 铝敏感突变体的筛选、基因克隆和功能分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 突变体库筛选材料的筛选 |
| 2.2.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 2.2.3 基于MutMap的基因克隆 |
| 2.2.4 CAPS标记验证突变位点 |
| 2.2.5 载体构建 |
| 2.2.6 水稻转基因及阳性苗的鉴定 |
| 2.2.7 突变体长期抗铝性鉴定 |
| 2.2.8 植物材料短期处理方法 |
| 2.2.9 GUS载体构建及GUS染色 |
| 2.2.10 RNA提取和定量表达分析 |
| 2.2.11 ArPK蛋白性质预测 |
| 2.2.12 烟草亚细胞定位 |
| 2.2.13 原位荧光免疫定位 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 突变体筛选 |
| 2.3.2 Q581 的基因克隆及候选基因验证 |
| 2.3.3 35S:ArPK可回复突变体arpk铝敏感表型 |
| 2.3.4 突变体arpk对铝处理的时间和浓度响应 |
| 2.3.5 突变体arpk对其他毒害重金属及不同pH的响应 |
| 2.3.6 ArPK在根尖表达的模式分析 |
| 2.3.7 突变体arpk中 ART1 及其调控的下游抗铝基因的表达 |
| 2.3.8 ArPK蛋白性质预测及亚细胞定位分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 突变体arpk转录组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 材料的生长与处理 |
| 3.2.2 总RNA提取进行转录组测序文库构建及高通量测序 |
| 3.2.3 转录组分析后续实验探究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 测序数据质量评估及RNA-seq整体质量评估 |
| 3.3.2 差异表达基因整体分布分析及聚类分析 |
| 3.3.3 差异表达基因GO富集分析 |
| 3.3.4 差异表达基因KEGG富集分析 |
| 3.3.5 转录组分析后续实验探究 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 NAOD的转录抑制不影响突变体arpk抗铝性 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 基因表达的定量验证 |
| 4.2.2 外源添加鸟氨酸及精氨酸实验 |
| 4.2.3 转基因材料的构建 |
| 4.2.4 生物信息学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 突变体arpk中 NAOD转录被组成型抑制 |
| 4.3.2 抑制NAOD依赖的鸟氨酸线性合成途径不影响水稻的抗铝性 |
| 4.3.3 水稻精氨酸代谢中NAOGAcT可能补偿NAOD的功能 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 ODC依赖的Put合成途径异常影响水稻抗铝性 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.2.1 多胺含量的测定 |
| 5.2.2 水稻外源添加抑制剂实验 |
| 5.2.3 突变体arpk对其他金属胁迫的响应 |
| 5.2.4 qRT-PCR检测基因表达 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 铝处理下突变体arpk中 Put显着积累 |
| 5.3.2 DFMO可解除突变体arpk中 NAOD的转录抑制,缓解arpk铝毒害 |
| 5.3.3 突变体arpk中 ODC1 专一响应铝毒害 |
| 5.3.4 ADC途径对水稻抗铝性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 ODC依赖的Put积累导致突变体arpk对铝敏感 |
| 5.4.2 Put可能通过结合蛋白等影响水稻抗铝 |
| 第六章 铵通过抑制ODC转录减少Put合成缓解水稻铝毒害 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料和方法 |
| 6.2.1 植物材料与培养方法 |
| 6.2.2 氨基酸含量的测定 |
| 6.2.3 基因的定量表达 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 ArPK影响水稻种子中的游离氨基酸含量 |
| 6.3.2 实验条件下水稻幼苗早期根尖Arg的来源 |
| 6.3.3 高浓度NH_4~+能缓解arpk的铝敏感表型 |
| 6.3.4 高浓度NH_4~+对GS/GOGAT循环及精氨酸途径的影响 |
| 6.3.5 高铵对铝处理下ADC及 ODC表达的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 铝处理下水稻根尖中氮流动 |
| 6.4.2 高铵加铝处理诱导铵以最大的速率进行同化及转化 |
| 6.4.3 外源添加铵缓解arpk铝毒的模型 |
| 第七章 全文总结 |
| 7.1 主要研究结论 |
| 7.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及发表的学术论文 |
（8）细菌性斑疹病菌分离鉴定及其HrpG突变体诱导大豆抗病基因的挖掘和分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 大豆细菌性斑疹病研究进展 |
| 1.1.1 大豆细菌性斑疹病病原菌概况 |
| 1.1.2 大豆细菌性斑疹病的危害 |
| 1.1.3 大豆细菌性斑疹病的鉴定 |
| 1.2 病原菌与植物的互作机制 |
| 1.2.1 病原相关分子模式诱发的免疫反应(PTI) |
| 1.2.2 效应蛋白诱发的免疫反应(ETI) |
| 1.2.3 PTI反应与ETI反应的差异 |
| 1.3 病原菌的hrp基因和III型分泌系统 |
| 1.3.1 病原菌的hrp基因 |
| 1.3.2 病原菌的III型分泌系统 |
| 1.4 植物抗病性相关QTL定位研究 |
| 1.4.1 单标记作图法 |
| 1.4.2 区间作图法 |
| 1.4.3 复合区间作图法 |
| 1.4.4 多区间作图法 |
| 1.4.5 完备区间作图法 |
| 1.4.6 多性状作图 |
| 1.4.7 混合线性模型法 |
| 1.4.8 代换作图法 |
| 1.4.9 代换系群体在大豆基因定位中的作用 |
| 1.5 大豆抗细菌性病害的研究进展 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 病原菌XvNEAU001WT的分离和鉴定 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 病原菌XvNEAU001WT的基因组测序 |
| 2.3 突变体XvNEAU001Δhrp G的构建 |
| 2.3.1 试验材料 |
| 2.3.2 试验方法 |
| 2.4 植物材料与病原菌接种 |
| 2.5 转录组测序及分析方法 |
| 2.5.1 试验材料 |
| 2.5.2 试验方法 |
| 2.6 全基因组重测序分析方法 |
| 2.6.1 试验材料 |
| 2.6.2 试验方法 |
| 2.7 RNA分离与候选基因的qRT-PCR分析 |
| 2.8 大豆抗细菌性斑疹病的QTL定位 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病原菌XvNEAU001WT的分离与鉴定 |
| 3.2 突变体XvNEAU001ΔhrpG的构建和致病性分析 |
| 3.3 大豆特殊遗传背景材料的病原菌诱导RNA-Seq分析 |
| 3.4 差异基因的共表达模块分析 |
| 3.5 差异表达基因的挖掘 |
| 3.6 重要节点(hub)基因的挖掘 |
| 3.7 Hub基因的表达和单倍型分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大豆叶片存在多种细菌性病害 |
| 4.2 分离得到的病原菌中hrp相关基因的编码特征 |
| 4.3 RNA-seq与 QTL定位相结合确定候选基因 |
| 4.4 Ⅲ型效应因子与候选基因的互作 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（9）长雄蕊野生稻白化苗、落粒性和剑叶长度的遗传分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语英汉对照 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 QTL定位基本原理 |
| 1.1.1 遗传群体 |
| 1.1.2 分子标记 |
| 1.1.3 QTL定位方法 |
| 1.1.4 分离群体分组混合分析法BSA |
| 1.2 水稻白化研究进展 |
| 1.2.1 植物白化介绍 |
| 1.2.2 导致水稻白化的分子机理 |
| 1.3 落粒性研究进展 |
| 1.4 剑叶长度研究进展 |
| 1.5 长雄蕊野生稻的一般特性研究进展 |
| 1.5.1 长雄蕊野生稻抗病性及地下茎研究进展 |
| 1.5.2 长雄蕊野生稻杂种不育研究进展 |
| 1.5.3 其它性状 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 多年生长雄蕊野生稻白化苗的遗传分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 研究材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 多态性分子标记来源 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 作图群体的构建 |
| 2.2.2 基因型鉴定 |
| 2.2.3 遗传连锁图谱的构建 |
| 2.2.4 表型统计 |
| 2.2.5 BSA混合池分析 |
| 2.2.6 效应验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 野生稻和F_2群体白化苗和绿苗表型分析 |
| 2.3.2 白化苗QTL定位分析 |
| 2.3.3 BSA分离群体分组混合分析法 |
| 2.3.4 F_2群体基因型检测 |
| 2.3.5 F_2表型分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 环境对水稻白化的影响 |
| 2.4.2 定位结果的分析 |
| 2.4.3 长雄蕊野生稻携带白化等位基因的原因分析 |
| 2.4.4 后续研究展望 |
| 第三章 水稻落粒性QTL定位与遗传分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 研究材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 多态性分子标记来源 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 作图群体的构建 |
| 3.2.2 基因型鉴定 |
| 3.2.3 遗传连锁图谱的构建 |
| 3.2.4 表型统计 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 亲本与F_2群体表型分析 |
| 3.3.2 落粒性QTL定位分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 落粒性调查方法的选择 |
| 3.4.2 定位结果的分析 |
| 3.4.3 后续研究展望 |
| 第四章 水稻剑叶长度的定位与遗传分析 |
| 4.1 课题来源 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 研究材料 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 多态性分子标记来源 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 作图群体的构建 |
| 4.3.2 基因型鉴定 |
| 4.3.3 遗传连锁图谱的构建 |
| 4.3.4 表型统计 |
| 4.3.5 回交群体构建与效应分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 F_2群体剑叶长度表型调查分析 |
| 4.4.2 剑叶长度QTL定位分析 |
| 4.4.3 回交后代的验证 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 定位结果的分析 |
| 4.5.2 环境对剑叶长度表型的影响 |
| 4.5.3 回交后代结果分析 |
| 4.5.4 不同QTL定位软件对定位结果的影响 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 试剂配方 |
| 附录二 实验方法 |
| 附录三 实验仪器 |
| 附录四 2018 年早稻F_2群体剑叶长度表型数据 |
| 附录四 2018 年早稻F_2群体剑叶长度表型数据 |
| 附录六 2019年BC_4F_3群体剑叶长度表型数据 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（10）水稻温敏核雄性不育系育性转换机理及OsLHY基因调控光周期开花的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 水稻光温敏雄性核不育研究进展 |
| 1.1.1 引言 |
| 1.1.2 水稻P/TGMS的基因定位和克隆 |
| 1.1.3 水稻P/TGMS的分子机理 |
| 1.1.4 水稻P/TGMS系育性转换机理的研究进展 |
| 1.2 植物生物钟(Circadian clock) |
| 1.2.1 生物钟发展简述 |
| 1.2.2 植物生物钟的分子机制 |
| 1.3 生物钟与光周期开花调控 |
| 1.3.1 植物开花 |
| 1.3.2 拟南芥的光周期开花 |
| 1.3.3 水稻光周期调控开花 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 水稻TGMS育性转换机理研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与种植条件 |
| 2.2.2 花药形态观察及育性考察 |
| 2.2.3 花药的细胞学观察 |
| 2.2.4 RNA文库构建和测序 |
| 2.2.5 生物信息学分析 |
| 2.2.6 RNA-Seq 数据 q RT-PCR 验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Zheda13S是 TGMS材料 |
| 2.3.2 转录组数据总体质量分析 |
| 2.3.3 差异基因表达分析 |
| 2.3.4 差异表达基因的GO分析 |
| 2.3.5 差异表达基因的KEGG分析 |
| 2.3.6 差异表达基因转录因子分析 |
| 2.3.7 差异表达基因蛋白互作网络分析 |
| 2.3.8 差异表达基因蛋白互作网络的拓扑结构分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 绒毡层和小孢子中特异表达基因受温度诱导 |
| 2.4.2 转录因子参与了水稻TGMS系育性转换过程 |
| 2.4.3 UbL40与DNA介导的RNA聚合酶亚基相互作用诱导TGMS系育性转换 |
| 2.4.4 参与TGMS系育性转换过程的激酶 |
| 2.4.5 热激蛋白与激酶相互作用参与TGMS系育性转换 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 水稻生物钟基因OsLHY的功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 OsLHY基因的生物信息学分析 |
| 3.2.2 材料与种植条件 |
| 3.2.3 抽穗期的调查及农艺性状考察 |
| 3.2.4 OsLHY基因敲除载体的构建 |
| 3.2.5 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 3.2.6 转基因植株DNA提取和鉴定 |
| 3.2.7 OsLHY表达模式分析 |
| 3.2.8 亚细胞定位 |
| 3.2.9 生物钟基因以及开花基因的表达分析 |
| 3.2.10 双荧光素酶实验 |
| 3.2.11 酵母单杂交 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 OsLHY基因特性以及启动子区域顺式作用元件分析 |
| 3.3.2 OsLHY的进化分析 |
| 3.3.3 OsLHY的表达模式和亚细胞定位 |
| 3.3.4 OsLHY功能缺失导致水稻抽穗延迟 |
| 3.3.5 OsLHY功能缺失影响生物钟相关基因的表达 |
| 3.3.6 水稻开花相关基因在oslhy突变体中的表达 |
| 3.3.7 OsLHY对水稻开花相关基因转录活性的影响 |
| 3.3.8 OsLHY直接与OsGI、RFT1和OsELF3 启动子结合 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 OsLHY对水稻生物钟的影响 |
| 3.4.2 长日照条件下OsLHY通过影响Hd1和Ehd1 转录促进开花 |
| 3.4.3 LHY/CCA1 在长日和短日植物中对开花的影响不同 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录表1 本研究主要引物列表 |
| 附录表2 cluster2中DEGs最显着富集的生物学过程转录调控 |
| 附录表3 cluster2 中的转录因子 |
| 附录图1 Zheda13S在不同温度条件下的花粉育 |
| 附录图2 OsLHY抑制OsELF3 转录 |
| 附录Protocol1 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 附录Protocol2 水稻原生质体的分离及转化 |
| 作者简历 |
| 博士在读期间发表的论文 |
四、Isolation and genetic charac-terization of a fragile plant mutant in rice (Oryza sativa L.)（论文参考文献）
- [1]水稻雌雄不育突变体Osfma2的细胞学观察及基因图位克隆[J]. 张涛荟,王海宇,万华,张莉萍,谢振威,陈可毅,何晓栋,赵志刚,万建民. 中国水稻科学, 2022(01)
- [2]亚麻荠WRKY转录因子家族的鉴定及其介导盐胁迫响应的功能研究[D]. 宋亚楠. 山西农业大学, 2021
- [3]多组学分析揭示转录和表观遗传变化对于水稻适应缺铁环境的作用[D]. 孙硕. 浙江大学, 2021(01)
- [4]水稻花期耐热性与耐热QTL定位及候选基因分析[D]. 陈雷. 广西大学, 2021
- [5]水稻类病斑基因LML11的图位克隆与功能分析[D]. 徐乾坤. 西南大学, 2021(01)
- [6]桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究[D]. 郑莎. 西南大学, 2021(01)
- [7]水稻抗铝基因ArPK的克隆及其抗铝机制的研究[D]. 刘相培. 浙江大学, 2021(01)
- [8]细菌性斑疹病菌分离鉴定及其HrpG突变体诱导大豆抗病基因的挖掘和分析[D]. 邹佳男. 东北农业大学, 2020(07)
- [9]长雄蕊野生稻白化苗、落粒性和剑叶长度的遗传分析[D]. 王昊云. 广西大学, 2021(07)
- [10]水稻温敏核雄性不育系育性转换机理及OsLHY基因调控光周期开花的功能研究[D]. 李超. 浙江大学, 2021(07)