一、链酶卵白素-生物素法检测乙型肝炎产妇分娩的死胎肝组织中乙型肝炎病毒及其标志物的研究（论文文献综述）
赵月[1]（2014）在《人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎（HB）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种以肝脏损伤为主要特征的严重危害人类健康的传染病之一。由于HBV具有严格的宿主特异性,因而缺乏理想的细胞模型或动物模型,从而阻碍了HBV的研究。本研究采用人源HBV对沙鼠和C57BL/6小鼠进行感染试验,目的在于探讨人源HBV能否引起小鼠感染,并探讨小鼠作为研究HBV传播和致病机制的动物模型的可能性。本研究选取沙鼠和C57BL/6小鼠用作人源HBV阳性血清的人工感染试验动物,采用ELISA、PCR、Real-time PCR、免疫组织化学和Western blot等方法对人源HBV感染后沙鼠和C57BL/6小鼠的血清、粪便和肝脏等组织进行HBV相关病原和抗体的检测,来探讨HBV在沙鼠和C57BL/6小鼠体内的感染情况,并通过沙鼠和C57BL/6小鼠体内细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的定位和表达,初步揭示HBV感染致肝细胞损伤的机制。研究结果如下：1、人源HBV感染沙鼠后1d,在肝脏和肾脏组织中可检测到HBV DNA;感染后2d和4w,只在肝脏中检测到HBV DNA。感染C57BL/6小鼠后1d,肝脏中可检测到HBV DNA。在血清、粪便、脑组织和唾液腺中,未能检测到HBV DNA。血清ELISA检测结果表明,在感染后1w内,HBsAg和HBeAg在小鼠血清中呈一过性出现；感染后1w,在沙鼠和C57BL/6小鼠的血清中均可检测到HBsAb和HBcAb,而且HBsAb能够在整个试验过程中持续性在血清中被检测到。肝脏组织中HBV相关抗原免疫组化染色结果表明沙鼠和C57小鼠感染人源HBV后肝脏中可检测到抗原阳性信号,且强度随感染时间的延长而增强。Western blot检测发现在感染后7d沙鼠肝脏中HBV抗原PreS1蛋白有明显的表达。2、沙鼠和C57BL/6小鼠感染人源HBV后均出现明显的组织病理学变化,呈现典型的病毒性肝炎的病理学变化。主要表现为肝窦扩张、淤血,肝细胞胞浆疏松、颗粒变性,汇管区淋巴细胞浸润和胆管增生等,病变程度随感染时间的延长而显严重。电镜观察发现,试验组小鼠肝细胞结构松散,内质网扩张,线粒体出现严重肿胀、空化。肾小管.上皮细胞胞质疏松,线粒体肿胀、嵴消失,内质网囊泡化,可见髓鞘样小体,胞浆内可见病毒包涵体,胞核内可见病毒样粒子。3、肝脏组织中增殖与修复相关蛋白免疫组化染色结果表明HBV感染后,沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中PCNA和HSP70蛋白在体内表达出现先升高后下降的趋势,攻毒后蛋白表达显着高于对照组（P<0.05）,表明HBV感染后机体出现了相应的抗损伤机制来减少损害。4、细胞凋亡相关分子的免疫组化染色结果表明感染后沙鼠和C57BL/6小鼠体内Bax、Bcl-2、 Caspase-3和Fas/FasL的表达量均有不同程度的升高,显着高于对照组（P<0.05）,表明HBV感染后细胞凋亡的线粒体途径被激活,细胞凋亡在HBV感染导致肝细胞损伤的机制中发挥了重要作用。5、内质网应激（ERS）相关分子免疫组化染色结果表明感染后沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中GRP78、CHOP、JNK及Caspase-12的表达均显着高于对照组（P<0.05）。Western blot结果也证实感染后肝脏ERS相关分子的表达量较对照组均有所升高。ERS相关蛋白表达量的升高表明HBV感染后启动了内质网应激反应,促进了肝细胞的凋亡。6、对沙鼠肝脏线粒体DNA不同区域基因序列扩增,观察、分析比较了人源HBV感染8w后,沙鼠肝脏线粒体DNA水平的变化,发现人源HBV感染后在沙鼠肝脏线粒体DNA的D-loop、 CytB和CytC三个区域均出现了一个碱基位点的改变,这些改变可能与线粒体结构或功能的变化相关。上述研究结果表明,人源HBV感染可引起沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织发生明显的病理损伤和炎症反应,采用PCR、血清ELISA和肝脏免疫组织化学检测在感染鼠体内检到HBV DNA及其相关抗原的存在,HBV可在小鼠体内进行短期的复制表达,表明沙鼠和C57BL/6小鼠具有作为HBV感染动物模型的潜质。通过对HBV感染后沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏的细胞损伤、细胞凋亡和内质网应激等相关因子表达量的变化初步观察研究发现,HBV感染后可通过激活线粒体途径和内质网应激途径促进肝细胞的凋亡,这可能是HBV感染引起肝细胞损伤的重要机制。
潘楚芝,颜见,李裕军,陈骋,邓美海,林楠,许瑞云[2]（2013）在《家族聚集性肝细胞肝癌组织中 S 期激酶相关蛋白 2 和增殖细胞核抗原的表达及意义》文中认为目的探讨S期激酶相关蛋白2（Skp2）、增殖细胞核抗原（PCNA）在家族聚集性肝细胞肝癌（肝癌）组织中的表达及意义。方法回顾性研究2001年1月至2010年1月在中山大学附属第三医院行肝癌肝切除的79例患者临床资料。所有患者均签署知情同意书,符合医学伦理学规定。根据是否符合家族聚集性肝癌的诊断分为家族聚集性肝癌组（FH组）和非家族聚集性肝癌组（NFH组）。FH组34例,其中男6例,女28例;年龄（34±5）岁。NFH组45例,其中男8例,女37例;年龄（59±4）岁。另取40例正常肝组织作为对照。应用免疫组织化学方法（免疫组化法）检测Skp2、PCNA的表达,蛋白质印迹法检测Skp2、PCNA的蛋白含量。一般资料中的计量资料和Skp2、PCNA的蛋白含量比较采用t检验,一般资料中的定性资料和Skp2、PCNA的阳性表达比较采用χ2检验。结果 FH组与NFH组患者的性别、年龄、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性率、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV-DNA）定量、甲胎蛋白（AFP）、肝功能Child-Pugh评分、肿瘤有否肝外转移、有否肿瘤包膜、有否静脉癌栓等临床资料的比较差异均无统计学意义（P>0.05）。FH组肝癌组织Skp2、PCNA阳性表达的数密度分别为（37±3）、（57±5）个/高倍镜视野,NFH组分别为（17±3）、（38±4）个/高倍镜视野,FH组肝癌组织中的Skp2、PCNA阳性表达明显高于NFH组（t=2.12,3.14;P<0.05）。蛋白质印迹法检测结果发现,FH组肝癌组织中Skp2、PCNA的蛋白含量分别为2.7±0.3、2.4±0.4,NFH组分别为1.7±0.4、1.5±0.3,FH组肝癌组织中Skp2、PCNA的蛋白含量明显高于NFH组（t=0.15,0.13;P<0.05）。结论肝癌组织中Skp2、PCNA蛋白阳性表达上调,家族聚集性肝癌患者的肝癌组织中Skp2、PCNA的表达明显强于非家族聚集性肝癌患者的肝癌组织。
陈黎[3]（2011）在《HBV宫内感染体外模型的构建及cAMP调控子宫肌细胞COX-2表达的机制研究》文中指出乙型肝炎是中国的流行病之一,全世界有3.5人口感染乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）,其中至少有1/3在中国。中国目前有约3000万慢性乙肝患者和1.2亿无症状的携带者。作为全球免疫疫苗联盟计划的一部分,中国最穷困的省份中至少有1千1百多万人口已经接种到了乙肝疫苗,但是这远远达不到免疫及控制乙型肝炎病毒的传播的程度。尽管大部分的研究人员认同胎儿感染及新生儿早期的垂直传播是HBV传播的主要途径和方式,但是由于具体机制尚不清楚,故在我国HBV感染的高危因素仍然不能确定。目前,人们把HBV的垂直传播主要分为3种不同的方式:胎儿的宫内感染、产时感染及产后感染。对于后两种传播途径而言,HBV疫苗和免疫球蛋白的应用可以有效阻止其传播。因此,更好地了解宫内感染所致的HBV宫内传播对于明确HBV的传播途径是至关重要的。在整个妊娠过程中,胎盘的结构和功能是动态变化。越来越多的证据显示,胎盘对于病毒从母体面到胎儿面的垂直传播中发挥非常重要的作用,如HBV、HCV、HIV及CMV病毒等。先天性的病毒感染可能引起产后感染、胎儿畸形、甚至是胎儿的死亡。虽然经胎盘传播病毒是这种感染的重要方面,但是关于病毒经胎盘的垂直传播及胎盘屏障在病毒从母体到胎儿循环中的传播中所发挥的作用研究还非常少。尽管对于血脑屏障已经有了非常深入的研究,但对于胎盘屏障的建立和鉴定还未见报道,导致宫内感染缺乏一个可靠的体外研究模型,严重影响病毒宫内感染机制的研究,制约了宫内感染的有效治疗。因此,构建一种胎盘屏障体外模型用于病毒宫内感染的研究是当前势在必行解决的问题,从而为病毒宫内感染机制的阐明和治疗方法的探索奠定坚实的基础。同时,已经被证实有3个基本的结构层面:滋养层细胞、间隙细胞（主要是胎盘的单核巨噬细胞,如Hofbauer细胞）及人胎盘微血管内皮细胞参与到宫内感染中。胎盘屏障主要由滋养层细胞、人胎盘微血管内皮细胞及两者的基底层所构成,是营养物质以及某些药物、病毒、激素等从母体进入胎儿的必经之路。本研究运用原代培养的滋养层细胞和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）,采用三种不同的模式来构建胎盘屏障的体外模型:滋养层细胞单独培养,滋养层细胞和内皮细胞非接触性共培养及滋养层细胞和内皮细胞接触性共培养,发现两者的接触性共培养是能够最好的模拟正常胎盘结构和功能的体外胎盘屏障模型;然后我们利用病毒拷贝量高于107/ml HBV患者血清直接感染构建的胎盘屏障模型,进一步研究HBV病毒穿过及感染体外胎盘屏障模型的能力。基于HIV及CMV可以通过受体介导的方式引起宫内垂直感染,同时HBV可以感染外周血单个核细胞（peripheral blood monocyte,PBMC）,并在其中复制,我们推测HBV可能通过以下3种途径:1.机械性损伤:炎性反应所致直接或是间接损伤滋养层细胞或是脐静脉内皮细胞,产生细胞裂隙,导致基底膜通透性增高,从而HBV可以突破胎盘屏障第一层（滋养层细胞）,然后释放入绒毛间质;2.细胞传递性:感染HBV的PBMC通过与滋养层细胞发生瞬时的微融合而将其内的HBV传递给后者,滋养层细胞再将HBV极性释放入绒毛间质;3.受体介导性:滋养层细胞顶膜侧上某种受体可能介导了游离完整HBV颗粒的进入并在其中复制,然后将部分HBV自其基底侧膜极性释放入绒毛间质。由于受体介导病毒入胞是其最常见的入侵细胞的方式和已经证实HBV在体情况下可以引起胎盘的损伤,所以本研究中,将关注机械性损伤和受体介导性病毒感染途径。HBV受体的探索虽然已经有20余年的历史,先后发现10余种可能的蛋白质,但高亲和力的HBV受体尚未发现。树突状细胞特异的C型外源凝集素（dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN）通过甘露糖和海藻糖连接碳水化合物来识别病原微生物从而导致抗病毒的免疫反应。在许多糖化病毒免疫逃逸的过程中,DC-SIGN参与病毒进入并反式感染细胞的过程。同时,亦有研究证实其在HIV的母婴垂直传播中可能发挥重要的作用。除了在未成熟的树突状细胞上有分布和表达外,DC-SIGN也可以在PBMC、胎盘的血管内皮细胞、胎盘巨噬细胞中表达。我们前期的预实验结果也发现,DC-SIGN可以在滋养层细胞上表达。迄今为止,DC-SIGN作为受体的病毒包括HIV、CMV、埃博拉病毒（Ebola virus）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）,SARS冠状病毒及麻疹等（未见与HBV的相关报道）。所有的结构基础是与病原体的N-高甘露糖型糖链特异性结合,而HBV被膜蛋白的PreS2抗原也存在N-高甘露糖型糖链,HBV有与DC-SIGN结合的结构基础。鉴于DC-SIGN在胎盘上的分布,我们大胆推测DC-SIGN可能和HBV的宫内感染相关。基于以上分析,本课题首先是利用原代培养的滋养层细胞和人脐静脉内皮细胞构建一种胎盘屏障体外模型,并进行系统评价与鉴定;其次,采用HBV病毒感染胎盘屏障体外模型,明确胎盘屏障在HBV宫内感染可能的作用;然后应用胎盘屏障模型进一步研究DC-SIGN在HBV垂直传播中的可能作用,从而为HBV宫内感染机制研究与治疗提供新的实验依据。主要实验结果和结论如下:1、采用胰酶与DNA酶序贯消化法分离人早孕滋养层细胞,通过35%与45%Percoll两个梯度的不连续密度梯度离心对分离细胞加以纯化,使细胞产量达106/g以上。然后用抗HLA-DR的免疫磁珠进一步纯化早孕的绒毛滋养层细胞。应用细胞角蛋白和波形蛋白免疫细胞化学标记,发现细胞纯度达到90%以上,可从数量及纯度上满足后续体外感染要求。利用HUVEC和绒毛滋养层细胞接触共培养构建胎盘屏障体外模型,扫描电镜结果显示滋养层细胞穿过Tranwell小室,与HUVEC接触性共生长;透射电镜和激光共聚焦结果表明屏障构建后,细胞之间存在大量紧密连接;跨膜电阻检测发现构建的胎盘屏障能有效提高跨膜电阻;因此,构建的体外模型从功能和形态符合胎盘屏障的要求,为后续实验奠定基础。2、采用血清直接感染法进行滋养层细胞的HBV感染,模拟自然状态下HBV分别感染胎盘屏障中的滋养层细胞及内皮细胞,然后感染构建的胎盘体外屏障,探讨HBV感染胎盘屏障的可能性。结果显示HBV DNA在感染后的滋养层细胞及HUVEC的上清液中释放分别在72-96h及48-72h达到高峰。分别应用HBsAg、与CK7及Ⅷ相关抗原、HBcAg与CD105进行免疫组化双标染色,发现HBV可以感染人滋养层细胞和HUVEC及胎盘屏障的体外模型。而且胎盘屏障可以部分阻止HBV穿透母体面至胎儿面,所以在感染后的24h,共培养体系的外室上清液中HBV DNA仅能一过性的达到103/ml。尝试用不同检测法（传统的PCR法、Hirt法及质粒抽提法）检测感染HBV复制的金标准HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,感染HBV后的胎盘屏障未能检测出HBV cccDNA,所以HBV在胎盘屏障中是一过性的感染还是可以复制,尚没有定论。但至少,扫描电镜中我们在HBV感染后的体外模型中发现了HBV病毒样的颗粒。3、分别采用DC-SIGN抗体及siRNA基因沉默DC-SIGN试验,初步探讨DC-SIGN在HBV宫内传播中的作用,发现DC-SIGN抗体及RNA小片段干扰技术基因沉默DC-SIGN在HBV感染滋养层细胞和HUVEC的过程中有阻断作用,但对于体外构建的胎盘屏障阻断作用未见明显差异。进一步通过受体DC-SIGN重建,利用DC-SIGN质粒转染人胎肝细胞验证DC-SIGN增加了人胎肝细胞HBV易感性,故DC-SIGN是HBV经受体介导性进入胎盘屏障的宫内传播中的可能受体之一。以上结果表明,我们第一次成功构建了人胎盘屏障体外培养模型,也证实HBV可能从滋养层面向内皮细胞面穿过;尽管屏障本身对于病毒的侵入起到一定的阻断作用,HBV DNA在细胞共培养体系中仍然有一过性的增高;同时,高拷贝量的HBV病毒对于HUVEC有机械性损伤,但是共培养中未发现同样的现象;初步探讨通过DC-SIGN这个受体介导HBV入侵滋养层细胞的宫内传播的机制,旨在为HBV宫内感染机制的研究奠定实验基础,为宫内干预提供新的靶标。早产是临床上新生儿致死或是致畸的主要原因之一。尽管在过去20年中,对于早产已展开了深入的实验室和临床研究,其发生率仍然增高超过30%。早产发生主要是产程过早发动,其主要原因有宫内感染、子宫过度牵张和胎盘早剥。正是这些临床病理因素将子宫从静息状态变为收缩,从而导致分娩的发动。3’,5’-环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）作为经典的第二信使,影响了一系列的人体生理和病理反应,包括平滑肌的收缩和炎症反应。事实上,不仅生理状态下产生的化学物质（如松弛素、促肾上腺皮质激素分泌激素及降钙素基因相关肽）,就连病理状态下产生的化学物质（如β2肾上腺素激动剂）均是通过cAMP引发子宫舒张。但是,临床上我们也发现除了药物本身的对人体的副作用和快速抗药物反应外,其可能下调人体内?2肾上腺素激动剂受体的表达。所以,需要寻找才一种新的可以增高cAMP水平的其他机制,最近在对于小鼠的研究中发现,磷酸二酯酶4型抑制剂——rolipram,可以降低早产的发生。前列腺素（prostaglandins,PGs）对于早产和足月产产程发动,宫颈成熟和促进子宫肌收缩都发挥非常关键的作用。在临床治疗中,这些特性一方面用于诱导分娩的发生,另一方面前列腺素合成酶抑制剂又应用于抑制早产的发生。目前已知环氧合酶至少有3种不同亚型在子宫平滑肌上表达,而表达最多的环氧合酶2型。环氧合酶-2 （cyclo-oxygenase-2,COX-2）常被转录和转录后水平上被调控,能被生长因子,细胞因子及内毒素刺激增高;在产程发动后,子宫肌和羊膜层中COX-2的表达均上调。我们前面实验中研究证实炎性细胞因子IL-1β可以通过NF-κB增高COX-2的表达,而且IL-1β和牵张也可以通过MAPK上调COX-2的表达。已经有研究表明在不同的组织中cAMP能够降低NF-κB和MAPK活性。然而新近研究发现,PGI2可以通过cAMP/PKA信号转导通路导致一系列收缩相关蛋白的表达,如连接蛋白43、α-平滑肌肌动蛋白、h-钙调蛋白结合蛋白、钙结合蛋白、平滑肌肌凝蛋白重链,这一结果提示在某些特定的信号下,cAMP可能在分娩发动前促进子宫肌的活性。临床上某些cAMP激动剂作为抑制宫缩的药物,可能在某些特殊的环境下也能引起子宫的收缩,所以本研究中我们发现cAMP能够上调COX-2的表达并对其机制进行研究。主要实验结果和结论如下:1、利用不同的cAMP激动剂（8-bromo-cAMP、forskolin、rolipram）在不同浓度作用不同时间刺激原代培养的子宫肌细胞,结果发现8bromo-cAMP提高COX-2表达在6和24h,rolipram和forskolin也用相似的生物学效应。随后的浓度依赖性实验发现,在1、6h时相点,forskolin增高COX-2 mRNA。同时COX-2蛋白合成水平的测试得到相似的趋势结果。ELISA结果也提示COX-2作用产物PGE2、PGI2、PGF2?生成在24和48h是持续增高的。2、采用cAMP下游效应物（PKA、EPAC、AMPK）的激动剂、抑制剂、shRNA技术基因沉默作用于子宫肌细胞,结果显示这些效应即不能被目前所知的cAMP下游效应物（PKA、EPAC和AMPK）激动剂所复制,也不能被其特异的抑制剂所阻截;shRNA技术基因沉默这些效应物,甚至是PDZ-GEF1,2,也不能抑制cAMP对COX-2调节作用。3、进一步利用有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路及下游底物验证发现,cAMP通过MAPK信号通路提高COX-2的表达,而PGE2通过其效应物EP-2,再影响MAPK活性,最后促进COX-2的表达。以上结果表明,cAMP能够有效提高子宫肌细胞COX-2的表达,主要通过MAPK信号通路增加COX-2表达,COX-2活性的提高导致PGE2、PGI2、PGF2?生成增高,而PGE2通过其效应物EP-2,再影响MAPK活性,最终反馈调节COX-2的表达。为明确cAMP在子宫肌上的功能机制提供新的实验依据。
石晓红[4]（2011）在《DEC1在原发性肝细胞性肝癌中的表达及其临床意义》文中提出研究背景：肝脏是人体最重要的器官之一,它对人类的生存是不可或缺的。肝脏在能量代谢、消化吸收、解毒、红细胞的分解与清除、生化物质比如血浆蛋白、激素等的合成和降解很多方面发挥着重要的作用。由于其在机体的不可替代的战略性地位和它的多方面功能,肝脏与其他脏器相比也就更易于罹患多种疾病。其中包括病毒性肝炎,黄曲霉素B1中毒,酒精损伤,脂肪肝,肝硬化,肿瘤,药物损害。其中原发性肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是由以上各种慢性肝脏疾病所导致的的最严重的临床转归。HCC直接威胁到人类健康和生命。原发性肝细胞性肝癌是最常见的原发恶性肿瘤之一,严重危害人类的身体健康。它恶性程度高,进展快,预后差,侵袭性强。全球每年约有50至100万的新增病例,死亡患者接近六十万人。全世界肝癌发病率占肿瘤发病率的第五位,而病死率仅次于肺癌、胃癌,位居肿瘤相关死亡的第三位。其中约有80%的HCC患者发生于亚洲太平洋地区和南部非洲等地的发展中国家,这些地方同时又是病毒性肝炎的高发区。近年来,由于丙型肝炎病毒（HCV）感染的增加,HCC在西方社会的发病率正在逐年上升。中国目前每年新发肝癌约三十六万例,死亡超过三十三万人,占我国癌症发病率第三位和肿瘤相关死亡的第二位。HCC的发病是多因素、多步骤的复杂过程,受环境和遗传双重因素影响。流行病学及实验研究资料已表明乙型肝炎病毒（HBV）和HCV感染、黄曲霉毒素B1、酒精、肝硬化及性激素等与HCC发病相关。其中,HBV与HCV感染是最重要的因素,80%的HCC与HBV或/和HCV的慢性感染有关。同时85%的HCC的患者合并肝硬化。这些不同背景的慢性肝脏疾病在疾病的发生、发展及转归也各有其特点。它们分别具有不同的遗传、外在变化,包括不同的染色体异常、基因突变及不同的信号分子变化等。最近的研究发现,新陈代谢的失调,特别是脂代谢紊乱是慢性肝病导致HCC的主要诱因之一。bHLH（Basic helix-loop-helix）蛋白是一类具有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）结构的转录因子,该家族成员可通过HLH结构域相互作用形成同源或异源二聚体,并由HLH结构区的氨基端的碱性区识别并结合细胞类型特异性基因启动子或增强子中的E-box位点,从而调节这些基因的转录。由此bHLH蛋白在细胞分化、发育、增殖及肿瘤发生过程中发挥关键作用。DEC1 （Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1）蛋白具有bHLH结构域,属于bHLH类转录因子家族成员。它在机体各种生理功能中发挥重要的作用,比如细胞分化、增殖、凋亡、缺氧反应、免疫耐受和肿瘤形成。作为主要的时钟调节分子,DEC1与DEC2一起组成第五个时钟基因家族。它们与CLOCK、BMAL1、PER和CRY一起参与调节细胞内水平的生物周期节律。近年来DEC1在物质能量代谢和维持机体稳态方面的作用正在逐步被我们所认识。DEC1在机体多层面、多角度、多阶段的不同作用预示着它可能位于机体调节的焦点位置；联系各种功能、整合多种变化从而保持机体的稳态。在肿瘤的发生、发展过程中,DEC1的作用有组织细胞类别的特异性,在组织类型不同,起源不同的肿瘤中和肿瘤发展的不同阶段,DEC1具有不同的表达模式,可能扮演者不同的角色：在乳腺癌中,高表达的DEC1与肿瘤的高侵袭性相关；在胃癌中,DEC1在分化差,恶性程度高的患者中表达增加；与癌旁组织相比较,结肠癌组织中高表达DEC1; DEC1参与介导由UVB导致皮肤癌的信号传导过程；而在肺癌中,DEC1的表达的报道存在相反的两种结论。DEC1与肿瘤发生发展关系的研究尚处于起步阶段,具体作用机制尚不明确。DEC1作为癌基因或是抑癌基因,在不同来源的肿瘤及肿瘤发展的不同阶段所起的作用还需要进一步的研究和归纳。在肝脏中,已有研究发现,DEC1参与肝细胞的生物周期节律调节、新陈代谢的维护和再生性控制等各方面的调控。但是DEC1在肝脏疾病,特别是HCC形成中的作用还不清楚。到目前为止,还未见到原发性肝癌与DEC1关系的系统研究报道。为了探讨DEC1在原发性肝细胞性肝癌发生、发展中所起的作用。我们对DEC1在肝癌细胞、组织中的表达及其与原发性肝癌发生发展的关系进行了研究。目的：研究DEC1与原发性肝癌发生发展的关系,探讨其在原发性肝癌发病机制中的作用和意义。方法和步骤：研究对象：组织标本取自山东大学附属千佛山医院和济南市中心医院病理科,于2006年1月至2009年5月期间手术切除并经病理证实。176例肝组织标本包括126例来自于63例肝癌患者的癌组织及与其相对应的癌旁组织,50例正常肝组织标本来自于肝血管瘤患者的手术切除组织。所有的患者手术前均未接受过放射性治疗或化疗等抗肿瘤治疗。血管瘤患者根据病毒学指标检查均无病毒感染。63例肝细胞性肝癌患者中男52例,女11例。年龄35-77岁,中位数年龄56岁。50例血管瘤患者中男17例,女33例。标本的选取是随机的,并经过了当地伦理委员会的批准。63例肝癌患者的病理分级包括：高分化18例,中、低分化45例。收集患者的性别、年龄、肿瘤大小、HBV感染情况、是否伴随肝硬化和AFP水平等临床相关参数进行分析。随机选取12例乳腺癌标本和5例肺癌标本作为对照。12例乳腺癌根据组织学分级包括：Ⅰ级3例,Ⅱ级7例,Ⅲ级2例。5例肺癌包括2例腺癌和3例鳞癌。人肝癌细胞株：SMMC-7721,HepG-2,Bel-7402,Hep-3B细胞由本室传代培养保存；人正常肝上皮细胞株HL一7702由山东大学医学院免疫教研室馈赠。RT-PCR法检测肝癌细胞中DEC1mRNA的表达：利用TRizol法分别提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测DEC1mRNA在肝癌细胞和正常肝上皮细胞的表达情况。逆转录反应按照既定的反应体系进行逆转录。反应条件：50℃30min,99℃5min,5℃5min.PCR反应在PCR仪中扩增,DEC1基因的PCR引物序列：上游：5’-gtaccctgcccacatgtac-3’下游:5’-gcttggccagatactgaagc-3’扩增片段长度为395bp,反应条件为：94℃20 sec,56℃20sec,72℃20sec共35个循环。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。流式细胞术检测肝癌细胞DEC1的表达：应用流式的方法初步检测肝癌细胞株Be1-7402中DEC1蛋白的表达情况。Bel-7402细胞中加入抗DEC1多克隆抗体,37℃摇床上孵育90分钟。PBS缓冲液清洗后,加入FITC标记的二抗,室温孵育25分钟。1%多聚甲醛固定后,上机（FACSCalibur flow cytometry）检测。荧光标记物测定时,同时设立阴性对照管。细胞免疫化学方法检测DEC1蛋白在肝癌细胞的表达及亚细胞定位：人正常肝上皮细胞株HL-7702,肝癌细胞株HepG-2、Bel-7402分别传代后培养24小时,检测DEC1的表达和亚细胞定位。为避免肝细胞中内源性生物素的干扰,采用非生物素标记的免疫组化试剂盒（KIT-5010, Max Vision, Maixin.Bio, China）。棕色颗粒沉着代表DEC1蛋白表达阳性。肝组织中内源性生物素对免疫组织化学结果的干扰现象：在检测肝癌组织中STAT5a的表达时,分别以生物素标记和非生物素标记的二抗对同一来源的肝组织切片进行免疫组化测定。检测肝组织细胞中内源性生物素在肝组织免疫组化中的的干扰作用。评价肝组织细胞中内源性生物素对肝组织免疫组化的干扰状况,从而选择特异性强的免疫组化方法和试剂。免疫组织化学方法检测肝组织中DEC1的表达：免疫组化方法检测DEC1蛋白在肝癌组织及其癌旁组织的表达情况,分析DEC1的表达与肝癌分化程度的相关性,及与肝癌临床病理参数间的关系。将甲醛固定、石蜡包埋的标本于切片机上切取4μm厚的组织切片,放入60℃电热恒温培养箱中60 min。依次进行脱蜡、水化处理。将切片放入盛有0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.8）的耐热容器中,放入高压锅内煮沸3分钟进行抗原修复。3%过氧化氢溶液室温下孵育10 min灭活内源性过氧化氢酶。加入抗DEC1多克隆抗体,4℃湿盒过夜。二抗为非生物素标记（KIT-5010, Max Vision, Maixin.Bio, China）。DAB显色5分钟,苏木素复染,透明、封片。乳腺癌组织切片作为阳性对照,以PBS液代替一抗作为阴性对照。结果通过双盲法由两位有经验的病理专家独立评估。取结果一致的标本进行统计学分析。统计学处理：采用SPSS 11.0统计软件对数据进行分析。分类变量用卡方检验和Fisher校正检验分析。DEC1表达量与肝癌分化程度之间的相关性则采用Spearman相关性分析,p<0.05为差异有统计学意义。结果：1.DEC1mRNA在人正常肝上皮细胞株HL-7702中和人肝癌细胞株：SMMC-7721, HepG-2, Bel-7402和Hep-3B细胞中均有表达。结果通过分析软件对条带灰度进行半定量分析,以内参基因（β-actin）调整mRNA量的差异。结果显示正常人肝上皮细胞中DEC1的表达量高于人肝癌细胞株,但差别没有统计学意义。提示DEC1在转录水平的差异并不明显。2.流式细胞检测结果显示DEC1在肝癌细胞株Bel-7402中的标记率为56%,提示DEC1蛋白在肝癌细胞株Bel-7402中有高表达。3.免疫细胞化学染色结果可以对DEC1蛋白表达进行亚细胞定位,在人正常肝上皮细胞株HL-7702,肝癌细胞株HepG-2、Bel-7402中,DEC1蛋白在细胞核及细胞浆中表达阳性,但以HL-7702细胞核DEC1蛋白表达较强。4.生物素标记和非生物素标记抗体在肝组织免疫组化中的应用差别：对同一来源的肝组织标本,应用生物素标记的二抗检测肝组织细胞中的目的抗原时,胞浆内有弥散分布的棕黄色颗粒；而应用非生物素标记的二抗,胞浆的显色则为阴性。5.正常肝组织标本中DEC1的表达特点：在正常肝组织中,DEC1的表达模式为：弥散性的肝细胞胞浆阳性表达,伴随着不同程度的胞核阳性表达。中央静脉周围的肝细胞胞浆中可见DEC1蛋白的颗粒性表达,而在汇管区周围的肝细胞胞浆中没有这种表达方式。DEC1蛋白不同的肝细胞胞浆表达模式可能与肝小叶特殊的解剖结构及独特的血液供应模式有关。中央静脉周围通常低氧、低养分、并具有较高的酸度,这些特点可能导致了肝细胞的颗粒型表达模式；DEC1蛋白的弥散型表达模式可能是非缺氧依赖性的。血管内皮细胞和胆管上皮细胞呈现不同程度的DEC1表达阳性。6.肝癌及癌旁组织中DEC1的表达特点：在几乎所有肝组织标本中的肝细胞中,DEC1在细胞浆中均有弥散性表达。肝癌组织中DEC1核表达的阳性率为57.1%（36/63）；而在相对应的癌旁组织中DECl核表达的阳性率为27.0%（17/63）。与肝癌组织相比,癌旁组织中DEC1的核表达降低（P=0.001）。正常对照中的DEC1的核表达率略高于肝癌组织,差别没有统计学意义（P=0.650）。与正常对照肝组织中的DEC1核表达率相比,癌旁表达低（P=0.002）,这可能与肿瘤的机械性挤压和肝细胞对于肝癌细胞的反应性有关。7. DEC1的核表达与临床参数之间的关系：肝癌组织中有36例标本DEC1核表达阳性,其中占高分化、中分化和低分化肝癌的百分比分别为：94.4%（17/18）,42.4%（14/33）和41.7%（5/12）。DEC1的核表达率与肝癌组织分化程度有关。在高分化肝癌中DEC1的核表达率高于中、低分化的肝癌,差别有统计学意义（P<0.001）。DEC1的核表达与性别、年龄、肿瘤大小、乙型肝炎病毒感染和肝硬化等临床参数无关。具体数据可能与样本量偏小有关,尚需大样本资料证实。8. DEC1核表达与肝癌分化程度的关系：作为转录因子,DEC1通常在细胞核内发挥作用。我们发现,在分化程度好的肝细胞性肝癌中,DEC1的核阳性表达率及核阳性表达强度均较高。在分化较差的肝细胞性肝癌中,DEC1的核表达较弱,甚至不表达DEC1蛋白。我们比较了DEC1的核免疫反应性与肝细胞性肝癌分化状态的关系。在高分化、中度分化和低分化肝癌中,DEC1核高表达的比率分别为83.3%,27.3%和16.7%。DEC1蛋白的核表达强度与肝细胞性肝癌的组织分化程度呈正相关（r=0.376,P=0.024）。结论：1.人肝组织标本肝细胞胞浆的内源性生物素影响着免疫组化结果的判断,因此对于此类标本,应首先选择非生物素标记的二抗。2.在肝癌细胞株中和正常肝上皮细胞株中,DEC1mRNA均有表达,DEC1蛋白在胞浆和胞核中均有表达。DEC1在肝脏的诸多日常功能中可能发挥重要作用。免疫组织化学方法证实DEC1在肝细胞内有两种表达模式,弥散型和颗粒型。弥散型的表达模式可能是非缺氧依赖型的。颗粒型的表达模式与中央静脉周围的特殊环境因素有关。3.证实在肝细胞性肝癌组织中,DEC1的核表达与肝癌的分化程度相关,DEC1的表达量与分化程度成正比。DEC1可以作为肝细胞性肝癌分化程度的标志物之一。为进一步探索DEC1基因功能及其在肝脏肿瘤中的生物学作用奠定了基础。DEC1的表达、调节和作用有组织特异性。在肝脏中,DEC1参与调节物质、能量代谢和时钟控制等多种生理功能,并且与肿瘤的生成有关,因此DEC1可能位于这个复杂转录调节网络的中心位置。机体组织、细胞中DEC1表达的紊乱打破了整体的稳态,从而导致细胞不正常的增殖、分化和死亡和癌症的发生。4. DEC1参与正常肝细胞的生物周期节律调节、新陈代谢的维护和再生性控制等各方面的调控。在正常肝细胞中发挥重要的稳态作用,其中主要是通过核内表达的DEC1蛋白发挥转录调控作用。而在肝癌组织中随分化程度由高到低,DEC1核表达逐渐降低,其作为转录因子发挥的调控作用减弱,造成细胞内稳态失衡,肿瘤进一步恶化。
吴国英[5]（2008）在《乙型肝炎病毒表面抗原在人卵母细胞和早期胚胎中的表达》文中研究指明研究背景:乙型肝炎病毒感染是一个全球性健康问题,主要流形于亚洲、非洲、南部欧洲和拉丁美洲,全球有20亿人有既往或持续感染乙肝的血清学证据,全球有约3.5亿的慢性HBV感染者,乙型肝炎病毒与急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的发生发展密切相关,其中约15～25%要死于HBV相关的终末期肝硬化和肝癌,每年＞100万死于急慢性HBV感染,中国有1.7亿的HBV慢性感染者。HBV主要通过血液、母婴传播、性接触传播和密切生活接触等途径引起传播,国内的慢性HBsAg携带者中约有40%是通过母婴传播所致,部份婴儿在宫内即受到HBV感染,宫内感染率为5～10%,垂直传播是我国HBV感染的重要形式。广义的垂直传播是指母婴或父婴间的传播。而真正意义上的垂直传播是指病毒感染患者的生殖细胞,在受精时由精子或卵细胞作为载体,经受精卵将病毒基因带到胚胎进而使子代患病。按性别划分,垂直传播又分为父婴垂直传播和母婴垂直传播。以人精子为载体传播已有较多的研究,而通过人卵母细胞传播却很难开展,主要是因为卵母细胞获取太难,至今未见人类着床前早期胚胎HBV研究的报道。但在动物实验中已有较多的研究证明HBV可以通过卵母细胞传递至子代。研究目的:本研究拟在先前的实验已证实HBVDNA在卵母细胞及早期胚胎中存在的基础上,采用免疫荧光方法检测卵母细胞和早期胚胎内HBsAg的表达,以进一步证实HBV对卵母细胞的感染及其转录活性,为研究HBV是否通过卵母细胞及精子传递至子代提供直接证据。材料与方法:实验组:卵母细胞:需要ⅣF的妇女为HBV携带者手术后未受精的卵母细胞,19个。早期胚胎:同期进行ⅣF的夫妻双方任一方为HBV携带者手术后废弃的早期胚胎,56个。阴性对照:同期进行ⅣF的夫妻双方均不是HBV携带者手术后未受精的卵母细胞9个及废弃的早期胚胎19个。阳性对照:HBV感染的肝癌细胞系。用免疫荧光法检测卵母细胞及早期胚胎中HBsAg的表达。结果:在实验组的人卵母细胞（2个）及早期胚胎中（3个）可以检测到FITC的阳性信号,阳性率分别是10.5%和5.4%,而在阴性对照组中未检测到。FITC荧光在卵母细胞中的表达量不尽一致,胚胎中有单个细胞的单一表达,有单个细胞的多点表达,也有一个胚胎中多个细胞的多点表达。结论:HbsAg在人卵母细胞及早期胚胎中有表达,HBsAg的表达量并不一致,HBV能够以卵母细胞及精子载体传递至子代。
陈宗艳[6]（2008）在《DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用》文中提出鸭乙型肝炎病毒（Duck Hepatitis B Virus,DHBV）与乙型肝炎病毒（Hepatitis BVirus,HBV）同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸（GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326）,具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1～30aa内有一个明显的信号肽,在19～20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a（+）/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法（间接法）;同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应（fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）检测方法。建立的标准曲线循环阈值（cycle threshold,Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d～30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3～52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1～3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12～31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高（P＜0.01）,乳酸脱氢酶活性升高（P＜0.01）,肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物（代号PNA）的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8～62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组（50mg/kg）基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。
杜娟[7]（2008）在《乙肝病毒核心抗原和截短型中蛋白对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）在感染肝细胞中极易发生基因片段的整合从而导致病毒在机体内长期存在不易被清除,如今已经成为世界性难题。目前关于乙肝及其所致肝癌的发病机制还不是很明确。但已有研究证实,HBV感染所致肝细胞凋亡失衡在乙肝患者肝细胞损伤及其乙肝患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视的、甚至是决定性的作用。TNF相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是继FasL之后被发现、命名的肿瘤坏死因子家族新成员。TRAIL区别于TNF家族其他凋亡分子的突出特点是可特异性诱导肿瘤细胞或病毒感染细胞凋亡,而不影响正常组织细胞的功能。现有的研究表明,TRAIL诱导的凋亡在机体清除巨细胞病毒（CMV）、脑心肌炎病毒（ECMV）等多种病毒感染细胞的过程中发挥重要作用。那么关于TRAIL在HBV的致病过程,及其在HBV相关肝癌中的作用机制至今尚不清楚。HBV病毒包含4个开放读码框架（open reading frame,ORF）,这些读码框架往往以基因片段的形式整合入肝细胞内,分别编码出相应的病毒蛋白。根据HBV感染这一特性,我们课题组提出HBV全基因组、各个基因片段所编码的病毒蛋白是否对TRAIL诱导的凋亡发挥作用呢?这些作用的后果是否造成了乙肝患者的病情不同转归呢?经过研究,我们首次提出HBV全基因组、HBx蛋白、截短型中蛋白（Truncated middle surface proteins,MHBs（t））能够上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡,并且发现HBV全基因组、HBx蛋白通过上调凋亡通路分子Bax表达发挥上调机制。那么,截短型中蛋白（MHBs（t））上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡的机制是什么呢?另一关键性基因区段编码蛋白HBV核心抗原蛋白（HBV core antigen,HBc）在TRAIL诱导凋亡发挥怎样的作用呢?在前期研究基础上,本课题率先开展了有关HBV核心抗原对TRAIL凋亡的影响及其分子机制的研究和截短型中蛋白上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡的机制研究,并取得了一定的研究成果。目的:1.探讨HBV核心抗原（HBcAg）对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制的研究。2.探讨截短型中蛋白（MHBs（t））上调TRAIL诱导肝细胞凋亡的分子机制。方法:1.HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响1.1包含HBc基因真核表达载体的构建设计、合成针对HBc基因的特异性引物,以pUC19/3HBV（adr亚型）为模板,PCR扩增获得相应的基因片段。PCR反应产物经酶切定向克隆入真核表达载体pcDNA3.0内,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经抗性筛选、酶切、DNA测序鉴定获得阳性重组子,并被分别命名为pcDNA-HBc。1.2稳定表达HBc蛋白肝癌细胞模型的建立pcDNA-HBc及空载体对照pcDNA3.0以阳离子脂质体介导的方式分别转染肝癌细胞BEL7402,SMMC7721。经G418筛选4周后,获得阳性细胞克隆。传代扩增,获得稳定细胞株,并分别命名为BEL7402-HBc、BEL7402-pcDNA3,及SMMC7721-HBc、SMMC7721-pcDNA3细胞。半定量RT-PCR分别检测HBcmRNA的表达,Western blot检测HBc蛋白质的表达。1.3尾静脉高压注射建立HBc在体内肝细胞表达模型BALB/c小鼠通过尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,免疫组织化学检测小鼠肝组织内HBc的表达,HE染色,血清ALT水平检测肝脏炎症。1.4 HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响细胞模型检测:不同浓度TRAIL分别作用BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc:SMMC7721、SMMC7721-pcDNA3、SMMC7721-HBc细胞,24h后CCK-8法检测不同浓度TRAIL对各组细胞的生长抑制情况,确定最佳作用浓度。以10ng/mL TRAIL作用于BEL7402各组细胞,24h后TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;caspase 3活化水平检测试剂盒检测caspase 3活化水平。以100ng/mL TRAIL作用于SMMC7721各组细胞,24h后TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。同时设计合成针对HBc的反义寡核苷酸,TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响。另外,TUNEL检测BEL7402-HBx细胞中转染HBc对TRAIL诱导凋亡效应的影响。动物体内模型检测:尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,TUNEL原位标记法检测各组小鼠模型肝切片中肝细胞凋亡情况。TUNEL流式细胞术检测各组小鼠模型肝细胞凋亡率。2.HBc的表达影响TRAIL诱导凋亡的机制研究1)胞膜受体水平:细胞模型检测:半定量RT-PCR分别检测BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc;SMMC7721、SMMC7721-pcDNA3、SMMC7721-HBc细胞中TRAIL受体mRNA水平的表达,Western blot、流式细胞术检测各组细胞TRAIL受体蛋白质水平的表达。动物体内模型检测:尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,分别通过免疫组织化学、流式细胞术以及Western blot检测各组小鼠模型中DR5蛋白水平的表达情况。临床标本检测:取110例慢性乙肝病人血清,分别检测血清中乙肝病毒核心抗原阳性率和血清中sDR5表达。免疫组化检测慢性乙肝患者肝穿刺标本免疫组化检测DR4、DR5的表达。2)胞浆凋亡通路水平细胞模型检测:Western blot分别检测10ng/mL TRAIL作用24h后,BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc细胞procaspase3、8、9,Bid的表达水平。RT-PCR、Western blot检测各组细胞Bax、FLIP的表达水平。动物体内模型检测:尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,Western blot检测各组小鼠肝细胞Procaspase 3,8,9及其Bid的表达。3)基因转录水平HBc对DR5启动子活性的影响:BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc细胞中同时转染DR5启动子的报告质粒pDR5PF。48h后,采用双荧光素酶报告基因（Dual Luciferase Reporter,DLR）检测系统检测荧光素酶活性。3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究稳定转染细胞BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc经Trizol法提取总RNA。经RNA纯化与质检,质检合格后RNA送检进行芯片实验。4.截短型中蛋白上调肝癌细胞凋亡的分子机制Western blot检测BEL7402、BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs（t）细胞中ERK2的磷酸化水平。PD98059抑制ERK2磷酸化以后:TUNEL流式细胞术检测BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs（t）细胞在TRAIL作用下的凋亡情况;Western blot检测BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs（t）细胞中procaspase 3、8、9表达情况。结果:1.HBc的表达下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡1.1成功构建pcDNA-HBc真核表达载体以pUC19/3.0HBV为模板,PCR成功扩增HBc基因片段,酶切、连接构建重组载体,并成功转化宿主菌,经Ampr抗性筛选、酶切鉴定、DNA序列分析获得阳性重组质粒pcDNA-HBc。1.2成功建立稳定表达HBc的肝癌细胞模型pcDNA-HBc或pcDNA3.0转染肝癌细胞BEL7402、SMMC7721获得稳定细胞株,分别命名为BEL7402-HBc、BEL7402-pcDNA3及SMMC7721-HBc、SMMC7721-pcDNA3细胞。半定量RT-PCR及Western blot可在细胞中检测到HBc mRNA和蛋白的表达。1.3尾静脉高压注射法成功建立HBc在体内肝细胞表达模型尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四中不同质粒组合。48h后,免疫组织化学法可检测到小鼠肝组织内有明显的HBc的表达,而在对照组肝组织未检测到表达。HE染色结果显示,pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组比pcDNA-HBV1.1注射组炎症反应的程度明显降低。血清ALT水平检测显示pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc组ALT值明显低于pcDNA-HBV1.1（P＜0.01）。1.4 HBc的表达下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡细胞模型检测CCK-8检测结果显示,相同浓度TRAIL作用下,BEL7402-HBc细胞较对照组细胞的生长抑制率明显降低,当作用浓度为10ng/mL时,差异最为显着,因此将该浓度作为其后实验的作用浓度。同样,SMMC7721-HBc细胞较对照组细胞的生长抑制率明显降低,当作用浓度为100ng/mL时,差异最为显着,因此将该浓度作为其后实验的作用浓度。TUNEL流式细胞术结果显示,10ng/mL和100ng/mL TRAIL分别BEL7402-HBc和SMMC7721-HBc细胞后,与对照组细胞相比凋亡率明显降低（P＜0.01）。化学底物显色实验结果显示,在10ng/mLTRAIL作用下,BEL7402-HBc的caspase 3活化水平明显低于对照组（P＜0.01）。同时设计合成针对HBc的反义寡核苷酸,TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响。TUNEL结果显示,反义封闭HBc后,BEL7402-HBV1.1细胞的凋亡率明显上调（P＜0.01）。另外,BEL7402-HBx细胞中转染HBc后,凋亡率明显下调（P＜0.01）。动物体内模型检测TUNEL原位标记法显示:pcDNA-HBV1.1注射组肝细胞显示凋亡的绿色荧光强且密集,而pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组凋亡信号明显减弱。TUNEL流式细胞术显示,pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组肝细胞凋亡率显着低于pcDNA-HBV1.1注射组（P＜0.01）。2.HBc的表达下调TRAIL诱导凋亡的机制研究1)胞膜受体水平:细胞模型检测:半定量RT-PCR、real-time PCR、Western blot和流式细胞术结果显示,HBc转染组细胞和对照组细胞相比,仅DR5的表达明显降低（P＜0.01）,而TRAIL其他三个受体在mRNA水平和蛋白质水平的表达均无显着性差异（P＞0.05）。动物体内模型检测:流式细胞术、Western blot以及免疫组织化学检测DR5蛋白水平的表达,结果显示:pcDNA-HBc注射组DR5表达明显低于pcDNA3.0注射组;同样,pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组DR5表达明显低于pcDNA-HBV1.1注射组（P＜0.01）。临床标本检测:对110例慢性乙肝病人血清中检测,结果显示:81%的患者血清中乙肝病毒核心抗原为阳性。慢性乙肝患者血清中sDR5水平明显低于正常体检人群（P＜0.01）。免疫组化检测结果显示,慢性乙肝患者肝穿刺标本DR5的表达明显低于正常对照组（P＜0.01）。2)胞浆凋亡通路水平:细胞模型检测:10ng/mL TRAIL作用下,BEL7402-HBc细胞中procaspase 3、8、9、Bid的表达水平显着高于对照组细胞（P＜0.01）。FLIP和Bax的表达无显着性差异（P＞0.05）。动物体内模型检测:Western blot检测小鼠肝组织Procaspase3,8,9及其Bid的表达结果显示,以上四个分子的表达在pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组的表达明显高于pcDNA-HBV1.1注射组（P＜0.01）。3)HBc降低DR5启动子活性:双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,DR5启动子相对活性在BEL7402-HBc细胞中的明显低于BEL7402-pcDNA3中（P＜0.01）。说明HBc能够明显降低DR5启动子活性。3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究基因芯片结果显示:DR5表达在BEL7402-HBc细胞组明显低于BEL7402-pcDNA3细胞组。另外,综合分析结果表明,获得的差异表达基因中,35%左右的基因为癌基因或者是抑癌基因。10%左右基因与肝癌发生相关。我们选择了文献已经有明确报道的与肝癌发生相关的四个基因Sulf-2、ATIP1、LOXL1、DLC-1,进行实时定量PCR检测,结果与芯片检测结果一致。4.截短型中蛋白上调肝癌细胞凋亡的分子机制4.1截短型中蛋白促进ERK2分子的活化Western blot结果显示,BEL7402-MHBs（t）细胞中可以检测到磷酸化ERK2,而对照组中均未检测到。4.2 ERK2的磷酸化是MHBs（t）上调凋亡的关键因素PD98059抑制ERK2磷酸化后,TUNEL流式细胞术检测TRAIL诱导的肝细胞凋亡,结果显示:BEL7402-MHBs（t）细胞凋亡明显受到抑制,说明磷酸化ERK2在MHBs（t）上调TRAIL诱导肝细胞凋亡过程中起到关键作用（P＜0.01）。4.3抑制ERK2磷酸化可逆转MHBs（t）上调凋亡的的分子机制Western blot检测PD98059抑制ERK2磷酸化后对TRAIL诱导的procaspase 3、8、9活化的影响。结果显示:10ng/mL TRAIL作用下,BEL7402-MHBs（t）细胞procaspase 3、9的活化水平明显降低。从而进一步证明磷酸化ERK2在MHBs（t）上调TRAIL诱导肝细胞凋亡过程中起到关键作用。结论:1.HBc表达可降低TRAIL诱导肝细胞凋亡的敏感性,证实HBc具有抵抗TRAIL诱导凋亡的生物学活性。2.HBc的表达可通过抑制DR5启动子活性来下调DR5蛋白的表达水平,并且可降低TRAIL传导通路中procaspase 3,8,9、Bid的活化水平,而TRAIL其他受体的表达和胞浆FLIP、Bax蛋白的表达无明显变化。3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究显示:HBc的表达可能与HBV相关肝癌的发生有一定的相关性。4.MHBs（t）可促使ERK2磷酸化,并且在MHBs（t）上调肝细胞凋亡过程中发挥关键作用。创新点及意义:1.本研究分别通过建立稳定转染肝癌细胞模型和硫代反义寡核苷酸封闭的方法,正、反向论证了HBV基因片段HBc在影响TRAIL诱导凋亡中的作用,并率先报道了HBc的表达可下调肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,为进一步深入阐明HBV感染相关疾病的发病机制提供实验依据,为临床治疗提供新的靶点。2.本研究从TRAIL凋亡通路的胞膜受体水平、胞浆凋亡通路水平及线粒体依赖途径和线粒体非依赖途径,深入探讨了HBc影响TRAIL诱导凋亡的分子机制,提出HBc可能通过调节线粒体依赖途径和非依赖途径凋亡信号的传导来影响TRAIL诱导的细胞凋亡。3.应用尾静脉高压注射法,在小鼠肝细胞内表达HBc基因,并在体内进一步证实HBc的表达可下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡,为HBc基因功能的体内研究建立了一种有价值的实验模型。4.应用双荧光报告载体系统首次提出HBc能够下调DR5启动子活性,为进一步的机制研究奠定基础。5.首次通过基因芯片的研究,提出HBc的表达与HCC发生的相关性研究是一项很有价值的研究课题。6.运用肝癌细胞模型率先报道了MHBs（t）可通过活化ERK2分子的表达,从而上调肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,为MHBs（t）在肝细胞凋亡中作用机制的研究奠定基础。
廖芝玲[8]（2007）在《uPA及V-ATPase在肝细胞癌的表达及其与浸润转移的关系》文中研究说明研究背景和目的:肝癌是我国高发的恶性肿瘤,而广西又是高发地区。肝癌的复发和转移是治疗和预后不良的关键。恶性肿瘤的转移过程主要包括肿瘤细胞从原发部位脱离,浸润细胞外基质,侵入淋巴管或血管,粘附在血管远处内皮细胞壁并向血管外迁移,形成新的转移灶等步骤。细胞外基质的降解是癌转移的必经步骤,基质蛋白水解主要通过组织蛋白酶/uPA/uPAR/MMPs/纤溶酶原网络系统实现,尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase typeplasminogen activator,uPA）在该过程中起关键作用。它被组织蛋白酶激活,继而激活纤溶酶原,再激活基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMPs）,发挥降解细胞外基质的作用。uPA和MMPs的过表达与许多肿瘤转移相关。大多数实体肿瘤是缺氧的,癌细胞通过葡萄糖酵解获得能量,酵解代谢过程产生多量的酸性产物,癌细胞尤其是有高转移潜能的癌细胞通常采取质子泵即Vacuolar-type H（+）-ATPase（V-ATPase）的途径将多产生的H+泵出细胞外,从而维持细胞内pH值稳定在正常范围,以保证细胞不因酸中毒而凋亡,同时造成癌细胞外酸性微环境。研究表明,能够在酸性环境中生存的癌细胞浸润能力增强,在酸性环境中组织蛋白酶、uPA和MMPs分泌增多且发生重新分布,在癌细胞表面和侵袭前缘分布增多,有利于侵袭、浸润和转移的发生。抑制V-ATPase能够抑制癌细胞酸性产物的排出,导致细胞内酸中毒凋亡,同时削弱癌细胞外酸性环境,不利于基质蛋白水解酶的分泌及细胞外基质的降解。过去关于HCC的研究以癌基因及旁路通道为主,尚未见将肿瘤微环境与肝癌相联系研究的报道。我们研究uPA和V-ATPase与肝癌发生和转移的关系,同时探讨抑制V-ATPase、干扰癌细胞H+泵出,使癌细胞酸中毒凋亡,寻找临床治疗的一个新的有效的靶点。材料和方法:1.标本来源:肝癌组织标本来源于2004年9月-2006年4月广西医科大学第一附属医院肝胆外科肝癌患者手术切除的病例共45例,取癌和癌旁组织,以距离癌肿边缘2cm以远为癌旁组织,其中,男39例,女6例,年龄21-72岁。以7例肝血管瘤旁组织做对照组。低转移潜能肝癌细胞株HCC97L购于复旦大学上海中山医院肝癌研究所。2.用RT-PCR和免疫组化SP法检测肝癌组织中uPA、MMP-9和V-ATPasemRNA和蛋白的表达;并分析它们表达间的相关性;将实验结果与病理、临床资料（伴有静脉癌栓及肝内外转移形成、乙型肝炎病毒感染、病理分级、血清AFP水平、肿瘤直径）进行比较分析。3.从肝癌组织中提取RNA,克隆uPA基因,构建原核表达载体,酶切鉴定,并送测序。4.构建真核表达载体,将重组质粒pCMV-uPA-HA送测序。将其转染低转移肝癌HCC97L细胞株,用抗生素筛选法筛选稳定转染细胞株,用RT-PCR和Western blot鉴定转染是否成功。5.用RT-PCR和western blot以及细胞免疫化学检测转染uPA细胞株和转染空载体细胞株中uPA及V-ATPase mRNA和蛋白的表达;6.肿瘤细胞体外迁移实验比较转染uPA基因和转染空载体细胞株的迁移能力;7.在细胞培养基中分别加入50和100nM浓度的V-ATPase抑制剂Bafilomycin A 1,肿瘤细胞体外迁移实验比较转染uPA基因细胞在Bafilomycin A 1的作用下迁移能力的变化;8.在细胞培养基中分别加入300、400、500nM的Bafilomycin A 1,12小时后收集细胞,用流式分析仪检测细胞凋亡情况;9.在细胞培养基中分别加入500、600、700nM Bafilomycin A 1,用CKK-8试剂盒检测在药物作用下细胞受抑制情况。结果:1.45例肝癌组织中伴有门静脉癌栓和/或肝内外转移者20例,不伴者25例,其它尚按病理分级、肿物直径、乙肝病毒感染、AFP水平分组;2.uPA mRNA在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为100%（45/45）、84.44%（38/45）,和28.57%（2/7）;癌与癌旁组及正常对照组比较均有显着性差异（P＜0.01,P＜0.05）。uPA蛋白表达阳性率在肝癌组、癌旁组和对照组分别为75.56%（34/45）、26.67%（12/45）、28.57%（2/7）,癌组分别与癌旁组及对照组比较有显着性差异（P＜0.01,P＜0.05）。肝癌组织中uPA mRNA和蛋白的表达与肝内外转移明显有关（P＜0.01）,而与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染、病理分级、血清AFP水平以及肿瘤直径无明显关系（P＞0.05）。3.MMP-9 mRNA在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为100%（45/45）、86.67%（39/45）、57.14%（4/7）;癌组分别与癌旁组及对照组比较有显着性差异（P＜0.01,P＜0.05）。MMP-9蛋白表达阳性率在肝癌组、癌旁组和对照组分别为66.67%（30/45）、22.22%（10/45）、14.29%（1/7）,癌组与癌旁组相比、癌组与对照组相比有显着性差异（P＜0.01,P＜0.05）。MMP-9 mRNA和蛋白的表达与静脉癌栓形成、肝内外转移明显有关（P＜0.01）,而与HBV感染、病理分级、血清AFP水平以及肿瘤直径无明显关系（P＞0.05）。4.V-ATPase mRNA在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为100%（45/45）、86.67%（39/45）和71.43%（5/7）;癌与癌旁组及正常对照组的阳性表达比较均有显着性差异（P＜0.05,P＜0.05）。V-ATPase蛋白在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为82.22%（30/45）、51.11%（10/45）、42.86%（3/7）,癌与癌旁组及正常对照组的阳性表达比较均有显着性差异（P＜0.05,P＜0.05）。V-ATP-ase mRNA和蛋白的表达与静脉癌栓形成、肝内外转移明显有关（P＜0.01）,而与HBV感染、病理分级、血清AFP水平以及肿瘤直径无显着相关（P＞0.05）。uPA mRNA与MMP-9 mRNA的表达呈正相关,uPA蛋白与MMP-9蛋白的表达亦呈正相关;uPA mRNA与V-ATP-ase mRNA的表达呈正相关,uPA蛋白与V-ATP-ase蛋白的表达亦呈正相关。5.从人肝癌组织中成功克隆uPA基因编码区,长度1332bp;成功构建真核表达载体pCMV-uPA-HA并测序,转染低转移潜能肝癌细胞株,获得稳定转染pCMV-uPA-HA HCC97L肝癌细胞株。经RT-PCR和Western blot检测,稳定转染株pCMV-uPA-HA细胞的uPA mRNA和uPA蛋白表达明显强于转染pCMV-HA细胞株和未转染细胞株。6.RT-PCR和Western blot方法检测表明,uPA、V-ATPase mRNA和蛋白的表达在转染uPA基因细胞株均强于转染空载体细胞株;细胞免疫化学显示,uPA和V-ATPase在转uPA基因细胞株的阳性表达明显强于转空载体细胞株,阳性物质定位于细胞浆和细胞膜,V-ATPase在胞膜的表达突出。7.肿瘤细胞体外迁移实验结果显示,转uPA基因细胞株覆盖创痕的速度快于转空载体株,提示细胞uPA合成、分泌和表达增强,促进癌细胞的迁移、浸润和转移。8.培养基中加入Bafilomycin A 1,细胞覆盖创痕的速度降低;100 nM浓度的抑制用作强于50nM;提示Bafilomycin A 1抑制V-ATPase,继而抑制细胞的迁移运动能力。9.流式仪器检测细胞凋亡实验:培养基中加入药物浓度为300、400、500nM的Bafilomycin A1,对照组凋亡率是1.22%,药物实验组凋亡率分别为4.31%、7.48%和20.6%;10.CKK-8试剂盒检测细胞抑制率:在培养基中加入500、600、700nM的bafilomycin A1药物,用CKK-8试剂检测,细胞抑制率分别为:32.63%、51.14%、58.67%。结论:1.uPA、MMP-9和V-ATPase mRNA和蛋白在肝癌组织中呈高表达,这种高表达与肝癌的浸润转移有关。2.随着肝癌细胞转移潜能的增高,V-ATPase表达增强,在细胞膜分布增加;3.用Bafilomycin A 1抑制V-ATPase,肝癌细胞的迁移能力降低,加大Bafilomycin A 1剂量,细胞受到抑制并出现凋亡。4.抑制V-ATPase会导致癌细胞向细胞外排出酸性物质的能力降低,细胞因酸中毒而死亡,可以考虑作为临床治疗肝癌的一个靶点。
王培林[9]（2007）在《乙型肝炎病毒基因组的垂直传递及其突变与表达》文中提出乙型肝炎（简称乙肝）是乙型肝炎病毒（HBV）感染所致,是一种难治性的严重危害人类健康的常见病与多发病,是与慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌发生关联的疾病。据统计,世界上约有3亿五千万人携带HBV,每年新增乙肝患者50万～100万,我国感染人数约占世界感染人数的50%。乙肝每年导致至少200万人死亡。然而,迄今乙肝尚无特异有效的临床治疗对策与措施,乙肝的发生率尚未显着降低。因此,HBV感染的传播方式受到研究者们的关注;乙肝经生殖细胞垂直传播的途径尚未得到证实,有关研究报道甚少。HBV是目前所知的最小的嗜肝病毒。HBV DNA长约3.2kb,构成HBV基因组,为部分双链环状病毒。HBV基因组共有4个开放阅读框架P、C、S和X区。本文报道了HBV基因组在男、女乙肝患者睾丸组织、卵巢组织中的基因复制、基因表达和基因突变,HBV基因组在乙肝患者父子、母子间垂直传递,HBV基因组小鼠卵细胞载体的构建和精细胞载体的构建与转HBV基因组小鼠的垂直传递。本研究从分子遗传学、细胞生物学和组织学等方面为HBV基因组经精细胞和卵细胞垂直传递提供了实验证据;乙肝患者的研究和动物实验证明,受到HBV感染的乙肝患者的生殖细胞能够把HBV基因组传递给其发病后出生子女。本文为乙肝垂直传播的理论提供了证据,为HBV感染的干预（如乙肝疫苗的应用等）提供了理论基础和依据。乙型肝炎患者父亲发病后出生子女本文首先研究分析了较大家系、样本的乙型肝炎患者父亲（HBF）、乙型肝炎患者父亲发病后出生子女（HBFa）和乙型肝炎患者父亲发病前出生子女（HBFb）各实验组血清游离型、外周血单核细胞（PBMC）整合型HBV基因组检测率和HBV感染率,发现HBF、HBFa组的3项指标显着高于HBFb组,HBF与HBFa组的3项指标呈一致性增高。说明HBFa组的HBV基因组有可能从HBF组获得。进一步分析了整合在HBF与HBFa基因组内的HBV基因组突变,发现HBF与HBFa父子之间具有完全一致的聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）单链泳动变位;所分析的的3个家系5个成员的HBF与HBFa的HBV基因组,有U5样序列区和非U5样序列区的3个位点的单核苷酸多态性（SNP）突变位点完全一致,HBF家系2301父子U5样序列区和非U5样序列区的10个位点的SNP突变位点完全一致。提示HBFa的所有HBV基因组的SNP都应是由整合有HBV基因组的HBF基因组通过精细胞传递所致。为了在产生精细胞的睾丸及附睾组织寻找到组织与细胞学证据,作者又研究了HBF的睾丸及附睾组织细胞内的HBV基因组,发现在HBF睾丸及附睾组织中存在大量的HBV基因组,主要分布在曲细精管的基底部。显然,为HBV基因组在父子之间的垂直传递提供了组织学和细胞学的证据。本文关于HBV基因组父子间垂直传递的研究为首次报道。第二,首次大样本的研究了乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）均阳性乙肝患者母亲（HBM）孕妇的卵巢组织样本HBV基因组基因的表达,检测HBsAg在卵巢组织的分布与表达,发现HBsAg主要分布在卵巢组织的血管管壁及周围的间质细胞内,在卵巢皮质的卵泡细胞胞质中检测到HBsAg。说明在卵巢组织和卵泡细胞内存有HBV基因组,卵巢组织和卵泡细胞受到了HBV的感染。为母婴之间HBV基因组通过卵细胞的垂直传递提供了组织学与细胞学的证据。进一步分析了HBM卵巢组织与外周血、HBM新生儿脐带血存在的HBV基因组。发现在HBM卵泡组织中检测到HBV基因组,其检测率与HBM新生儿脐带血中HBV基因组的检测率呈一致性增高,显着高于对照组。说明HBM新生儿细胞内的HBV基因组可能是来自HBM,是通过卵细胞传递而来。因为HBM孕妇的卵巢组织样本HBV基因组的免疫组化研究结果已提供了组织学与细胞学的基础。同时,本文进一步研究了HBM卵巢石蜡组织切片组织细胞内的HBV基因组与分布,发现在HBM卵巢组织中检测到HBV基因组,分别分布在卵巢皮质的卵泡细胞,髓质的血管管壁以及血管周围间质细胞中。说明HBV感染了卵巢组织,在卵巢组织和卵泡细胞中存在HBV基因组。又进一步为母婴间通过卵细胞垂直传递HBV基因组提供了组织学和细胞学的证据。本文关于HBV基因组母子间垂直传递的研究为首次报道。第三,应用人的生殖细胞进一步研究HBV基因组的垂直传递,涉及伦理学的问题,显然是不可能的。我们应用阳离子脂质体-质粒pBR322-HBV DNA共转染小鼠卵细胞,证明HBV基因组可以通过脂质体转染进入小鼠卵细胞,卵细胞可以作为HBV基因组的载体;为培育证明HBV基因组可以经卵细胞垂直传递子代的动物模型提供了前提条件。第四,运用精子载体共培养和体内转染法共转染小鼠精细胞,发现小鼠精子有一定俘获外源HBV基因组的能力,并发现HBV基因组在小鼠精细胞的分布。作者应用精子载体法建立了HBV基因组经精细胞垂直传播的转HBV基因组小鼠模型。为HBV基因组经生殖细胞垂直传递提供了实验证据。为HBV感染的垂直传播提供了实验证据。HBV基因组垂直传递的研究有助于探讨、阐明HBV感染传播的机制与途径。除在乙肝传播的理论上有所突破之外,还将为HBV感染的临床预防提供理论依据和基础;这在降低乙肝发生率、提高人口素质、优生优育等方面都有重要的临床意义。
薛璐[10]（2005）在《乙型肝炎病毒母婴传播高危因素的研究》文中研究表明目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个世界性的公共卫生问题,多在新生儿期或幼年期发生。慢性HBV感染以后可发展为慢性肝炎、肝硬化,还与肝细胞癌的发生密切相关。母婴传播是形成慢性感染的重要原因。目前国内外对乙肝病毒传播机制的认识尚不完全清楚,认为可能与胎盘、外周血单个核细胞、父系传播、母亲乳汁、体液以及围产期多因素有关。多数学者认为,接种乙肝疫苗是预防慢性乙型肝炎病毒感染及相关疾病的有效手段,在经济发达地区推行对乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）阳性孕妇进行产前被动免疫,生后新生儿进行主被动联合免疫的方法明显降低乙肝病毒的母婴传播,目前对产前被动免疫的阻断效果尚有争议。在进行主动免疫或主被动联合免疫的同时仍有10-20%的婴儿出现免疫失败,目前研究认为免疫失败的主要原因是宫内感染。针对上述情况,本课题通过对乙肝病毒母婴传播进行多因素研究并对主被动免疫进行综合评价,以进一步加强对乙肝病毒母婴传播的认识,降低HBV母婴传播率。 方法:本研究病例来自2002年8月至2005年1月于我院产科住院分娩的无症状HBV携带孕妇及其新生儿164例和母亲HBsAg阴性、父亲HBsAg阳性病例及其新生儿13例。根据母亲孕期是否进行被动免疫分为产前阻断组（110例）和产前未阻断组（54例）,各组再根据母亲血清HBsAg、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）阳性情况分单阳组和双阳组（产前阻断组分为单阳组68例,双阳组42例:产前未阻断组分为单阳组39例,双阳组15例）。产前阻断组中,HBsAg阳性孕妇自孕24周始肌肉注射乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）,每次200IU,共1～5次,每次间隔3～4周;所有新生儿生后1小时内、14天于右侧大腿前外侧肌肉注射乙型肝炎免疫球蛋白,每次200IU,并按0～1～6月顺序预防接种酵母基因重组乙肝疫苗,每次10μg。HBsAg阳性或配偶为HBsAg
二、链酶卵白素-生物素法检测乙型肝炎产妇分娩的死胎肝组织中乙型肝炎病毒及其标志物的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、链酶卵白素-生物素法检测乙型肝炎产妇分娩的死胎肝组织中乙型肝炎病毒及其标志物的研究（论文提纲范文）
（1）人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 乙型肝炎病毒与乙肝流行病学研究进展 |
| 1.1 乙型肝炎概述 |
| 1.2 HBV的发现 |
| 1.3 HBV分类 |
| 1.4 HBV的形态特点 |
| 1.5 HBV的复制周期 |
| 1.6 HBV的发病机理 |
| 1.7 HBV的基因型和分布 |
| 1.8 HBV在动物中的流行 |
| 1.9 HBV受体研究进展 |
| 2 HBV感染模型和动物模型研究进展 |
| 2.1 HBV感染的细胞模型 |
| 2.2 HBV感染的动物模型 |
| 3 HBV与细胞凋亡 |
| 4 HBV与内质网应激(ERS) |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病原学研究 |
| 试验一 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠的PCR和血清学检测 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 人源HBV阳性血清DNA含量测定结果 |
| 3.2 沙鼠和C57BL/6小鼠血清、组织和粪便中HBV DNA的PCR检测 |
| 3.3 感染鼠肝脏中HBV DNA含量Real-time PCR测定结果 |
| 3.4 感染沙鼠和C57BL/6小鼠血清ELISA检测结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验二 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠后HBV相关抗原的检测 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏中HBV相关抗原免疫组化检测结果 |
| 3.2 Western blot检测肝脏中HBV抗原 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验三 人源HBV体外与沙鼠和C57BL/6小鼠血液共培养试验 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 沙鼠和C57BL/6小鼠血液体外与HBV混合培养后DNA的PCR检测 |
| 3.2 PCR扩增序列比对 |
| 4 讨论和小结 |
| 第三章 人源HBV感染致沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏损伤机制的研究 |
| 试验一 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学变化观察 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HBV感染对肝脏脏器指数及血清AST、ALT的影响 |
| 3.2 HBV感染沙鼠的病理学变化观察 |
| 3.3 HBV感染C57BL/6小鼠的病理学变化观察 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验二 HBV感染对沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织PCNA及HSP70表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中PCNA的表达情况 |
| 3.2 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中HSP70的表达情况 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验三 HBV感染对沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中Bax和Bcl-2的表达情况 |
| 3.2 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中Fas和FasL的表达情况 |
| 3.3 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中Caspase 3的表达情况 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验四 HBV感染对沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织ERS相关分子表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏中内质网应激相关分子的蛋白量变化 |
| 3.2 Western blot检测HBV感染后肝脏中内质网应激相关分子蛋白量变化 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验五 人源HBV感染沙鼠线粒体DNA基因变化的观察 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 沙鼠线粒体D-loop基因的扩增结果 |
| 3.2 沙鼠线粒体CytC基因的扩增结果 |
| 3.3 沙鼠线粒体CytB基因的扩增结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 图版与说明 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）家族聚集性肝细胞肝癌组织中 S 期激酶相关蛋白 2 和增殖细胞核抗原的表达及意义（论文提纲范文）
| 资料和方法 |
| 一、一般资料 |
| 二、研究方法 |
| (一)免疫组化法 |
| (二)蛋白质印迹法 |
| 三、观察指标 |
| 四、统计学分析 |
| 结果 |
| 一、两组肝癌患者临床资料的比较 |
| 二、两组肝癌患者肝癌组织中Skp2、PCNA阳性表达的比较 |
| 三、两组肝癌患者肝癌组织中Skp2、PCNA蛋白含量的比较 |
| 讨论 |
（3）HBV宫内感染体外模型的构建及cAMP调控子宫肌细胞COX-2表达的机制研究（论文提纲范文）
| 常用英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 HBV宫内感染体外模型的构建及cAMP调控子宫肌细胞COX-2 表达的机制研究 |
| 前言 |
| 分题一 HBV宫内感染体外模型的构建 |
| 前言 |
| 第一部分 人胎盘屏障体外模型的构建、优化及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 HBV感染胎盘屏障体外模型的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 DC-SIGN在HBV感染胎盘屏障体外模型中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题一总结 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 分题二 cAMP调控子宫肌细胞COX-2 表达的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV宫内感染研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的论文 |
（4）DEC1在原发性肝细胞性肝癌中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 The Role of Differentiated Embryo Chondrocyte 1 in Liver Diseases |
| References |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文题录 |
| 发表外文文章1 |
| 发表外文文章2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）乙型肝炎病毒表面抗原在人卵母细胞和早期胚胎中的表达（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目次 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 观察指标 |
| 3 结果 |
| 3.1 患者一般临床资料 |
| 3.2 实验组及对照组各细胞中 FITC 荧光的表达情况 |
| 3.3 实验组荧光阳性数统计 |
| 3.4 阳性标本的病人乙肝血清标志 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 作者简历及在学期间发表的文章 |
（6）DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 鸭乙型肝炎病毒的研究进展 |
| 1 DHBV生物学特性 |
| 1.1 包膜蛋白 |
| 1.2 核蛋白 |
| 1.3 P蛋白 |
| 1.4 X抗原 |
| 2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型 |
| 2.1 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的建立 |
| 2.2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的应用 |
| 3 DHBV感染鸭动物模型 |
| 3.1 DHBV感染动物模型的建立 |
| 3.2 DHBV感染动物模型的影响因素 |
| 4 DHBV感染动物模型的相关研究及应用 |
| 4.1 DHBV感染鸭的各种动物模型 |
| 4.2 DHBV突变株的生物学意义 |
| 4.3 抗HBV药物筛选模型 |
| 4.4 液制品消毒学领域的应用 |
| 5 小结 |
| 5.1 存在的问题 |
| 5.2 展望 |
| 第二章 病毒功能性蛋白的原核表达及其应用的研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 病毒功能性蛋白表达采用的原核表达系统 |
| 2.1 原核表达系统 |
| 2.2 外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 |
| 2.3 影响克隆基因在大肠杆菌细胞中表达效率的因素 |
| 3 病毒功能性基因的原核表达 |
| 3.1 嗜肝DNA病毒的原核表达 |
| 3.2 鸭乙型肝炎病毒preS蛋白的功能及其原核表达 |
| 4 应用前景 |
| 4.1 preS蛋白的功能研究 |
| 4.2 preS抗原的诊断及预后作用 |
| 4.3 preS抗原与疫苗 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 DHBV阳性血清的分离、全基因组的克隆及序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 菌株及质粒 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 阳性血清的分离 |
| 2.2 DHBV全基因组的克隆 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 血清DHBV-DNA的分离 |
| 3.2 DHBV全基因序列扩增和克隆 |
| 3.3 四川麻鸭DHBV全基因测序结果 |
| 3.4 四川麻鸭DHBV全基因序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 DHBV PRES基因表达质粒的构建与表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及表达载体 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 常用材料与试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 扩增目的基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增目的基因 |
| 2.3 PCR产物的鉴定 |
| 2.4 原核表达质粒的构建 |
| 2.5 转化表达菌株BL21 |
| 2.6 诱导表达 |
| 2.7 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.8 Western blotting检测 |
| 2.9 表达蛋白的可溶性和不可溶性分析 |
| 2.10 表达条件的优化 |
| 2.11 重组蛋白的大量诱导表达 |
| 2.12 Ni—NTA亲和层析纯化重组蛋白的纯化 |
| 2.13 纯化蛋白的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2 T载体克隆及测序鉴定 |
| 3.3 原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.4 诱导表达 |
| 3.5 可溶性分析 |
| 3.6 免疫印迹 |
| 3.7 表达条件的优化 |
| 3.8 重组蛋白的纯化 |
| 3.9 SDS-PAGE分析纯化蛋白 |
| 3.10 纯化蛋白的应用 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 基于鸭乙型肝炎病毒PRES蛋白免疫组化方法建立及其病毒感染鸭的抗原定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
| 2.2 雏鸭人工感染DHBV标本采集 |
| 2.3 免疫组化检测DHBV方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫组化方法的建立 |
| 3.2 免疫组化检测各组织器官的定位研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫组化方法检测DHBsAg的建立 |
| 4.2 免疫组化方法检测DHBsAg建立的意义 |
| 4.3 免疫组化方法对DHBsAg的定位研究 |
| 5 小结 |
| 第六章 实时荧光定量PCR检测鸭乙型肝炎病毒方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 标准品的制备 |
| 2.2 待检标本的来源 |
| 2.3 FQ-PCR条件的建立和优化 |
| 2.4 FQ-PCR的敏感性检测 |
| 2.5 FQ-PCR的特异性检测 |
| 2.6 FQ-PCR的可重复性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 反应体系的优化 |
| 3.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.3 荧光定量PCR稳定性和重复性试验 |
| 3.4 荧光定量PCR特异性试验 |
| 3.5 荧光定量PCR敏感性试验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第七章 鸭乙型肝炎病毒在感染鸭体内侵染规律 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
| 2.2 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的病理组织学研究 |
| 2.3 DHBV在感染鸭体内的侵染和分布规律 |
| 2.4 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的血液生化指标的研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 病理组织学变化 |
| 3.2 免疫组化检测各组织器官的变化规律 |
| 3.3 DHBV-DNA在血清和肝组织中的变化规律 |
| 3.4 血液病理学变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 雏鸭人工感染DHBV后在体内的侵染规律及其意义 |
| 4.2 DHBV感染发病机理探讨 |
| 4.3 病理组织学和血液生化指标变化规律 |
| 5 小结 |
| 第八章 免疫组化、FQ-PCR和鸭乙型肝炎病毒感染模型联合评价抗人类乙肝新药的实验研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试药物 |
| 1.2 常用材料与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2 体外实验方法 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 HepG2 2.2.15细胞的传代与培养 |
| 2.3 细胞毒性试验 |
| 2.4 对细胞分泌(上清)的HBsAg、HBeAg的抑制试验 |
| 2.5 上清病毒基因组DNA的分离及定量检测 |
| 2.6 细胞总DNA的提取及定量检测 |
| 3 体内实验方法 |
| 3.1 毒株 |
| 3.2 主要试剂 |
| 3.3 实验动物及分组 |
| 3.4 鸭肝组织标本形态学观察 |
| 4 结果 |
| 4.1 受试药物对HepG 2.2.15细胞毒性作用结果 |
| 4.2 受试化合物细胞水平药效学研究结果 |
| 4.3 FQ-PCR检测血清和肝组织中DHBV-DNA的结果 |
| 4.4 病理学检查结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻博期间发表的论文 |
（7）乙肝病毒核心抗原和截短型中蛋白对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| (一) HBV感染与肝细胞凋亡 |
| (二) HBV感染与TRAIL诱导的肝细胞凋亡 |
| (三) HBV关键性基因区段与TRAIL诱导的肝细胞凋亡 |
| 总体技术路线 |
| 第一部分 乙肝病毒核心抗原(HBc)对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及机制探讨 |
| 第一章 含HBc基因片段真核表达载体的构建及表达 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 质粒与菌株 |
| 1.2 细胞和细胞培养 |
| 1.3 生化试剂 |
| 1.4 一般试剂 |
| 1.5 主要实验仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 HBc基因片段的PCR扩增、回收及纯化 |
| 2.1.1 PCR扩增HBc基因片段 |
| 2.1.2 HBc基因片段的大量扩增、回收与纯化 |
| 2.2 目的基因与载体的连接和重组子的转化 |
| 2.2.1 目的基因与载体的酶切、回收与纯化 |
| 2.2.2 目的基因与载体的连接 |
| 2.2.3 重组质粒的转化 |
| 2.3 阳性重组子的筛选与鉴定 |
| 2.3.1 碱变性法小量抽提质粒 |
| 2.3.2 酶切筛选阳性重组子 |
| 2.3.3 DNA自动测序与序列分析鉴定阳性重组子 |
| 2.4 HBc重组质粒稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 |
| 2.4.1 BEL7402、SMMC7721细胞的传代培养 |
| 2.4.2 基因转染 |
| 2.4.3 克隆筛选 |
| 2.4.4 稳定筛选细胞的鉴定 |
| 2.4.4.1 半定量RT-PCR检测HBc基因mRNA的表达 |
| 2.4.4.2 Western blot检测HBc蛋白的表达: |
| 结果 |
| 1.HBc基因片段的PCR扩增、回收及纯化 |
| 1.1 PCR扩增HBc基因片段 |
| 1.2 回收、纯化PCR产物 |
| 2.pcDNA-HBc真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 目的基因和载体的酶切回收 |
| 2.2 目的基因与载体的连接、转化 |
| 2.3 阳性重组子的筛选和鉴定 |
| 3.HBc基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 |
| 3.1 试剂盒小量提取质粒 |
| 3.2 阳性细胞克隆的筛选 |
| 3.3 稳定筛选细胞的鉴定 |
| 3.3.1 HBc mRNA表达的检测 |
| 3.3.2 HBc蛋白表达的检测 |
| 讨论 |
| 第二章 HBc表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡影响的体外研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 生物试剂 |
| 1.2 试剂盒 |
| 1.3 细胞和细胞培养 |
| 1.4 化学试剂 |
| 1.5 主要仪器设备及其它 |
| 2.方法 |
| 2.1 CCK-8检测TRAIL对细胞生长的抑制效应 |
| 2.2 TUNEL检测TRAIL诱导的凋亡效应 |
| 2.3 Caspase3的活性检测分析TRAIL诱导的细胞凋亡 |
| 2.4 反义封闭HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 2.4.1 PS-asODNs/HBc的设计、合成和溶解 |
| 2.4.2 PS-asODNs/HBc的反义封闭效率 |
| 2.4.3 TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 2.5 TUNEL检测BEL7402-HBx细胞中转染HBc对TRAIL诱导凋亡效应的影响 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.HBc转染降低TRAIL对细胞的生长抑制效应 |
| 2.HBc转染抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡 |
| 2.1 TUNEL检测结果 |
| 2.2 Caspase3活性检测的结果 |
| 3.反义封闭HBc的表达上调TRAIL诱导的凋亡 |
| 4.HBc转染逆转HBx对TRAIL诱导的凋亡效应 |
| 讨论 |
| 第三章 HBc表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡影响的体内研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 动物和动物饲养 |
| 1.2 质粒和菌种 |
| 1.3 生化试剂和试剂盒 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1 |
| 2.2 小鼠尾静脉高压注射法建立体内实验模型 |
| 2.3 免疫组织化学方法检测HBc在肝组织中的表达 |
| 2.4 HBc的表达对肝脏损伤的影响 |
| 2.4.1 小鼠血清谷丙转氨酶水平的检测 |
| 2.4.2 病理切片观察小鼠肝组织病理学改变 |
| 2.4.3 TUNEL染色检测肝细胞凋亡率 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.试剂盒大量提取质粒 |
| 2.HBc在小鼠肝组织内的表达 |
| 3.HBc的表达减轻乙肝病毒诱导的炎症反应和肝细胞凋亡 |
| 3.1 小鼠血清谷丙转氨酶水平 |
| 3.2 肝脏病理学改变 |
| 3.3 TUNEL检测肝细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 第四章 HBc表达抵抗TRAIL诱导凋亡的分子机制研究(体外) |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞和细胞培养 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 生化试剂和试剂盒 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 胞膜受体水平的检测 |
| 2.1.1 半定量RT-PCR检测TRAIL受体的表达 |
| 2.1.2 荧光定量RT-PCR检测DR5 mRNA水平的表达 |
| 2.1.3 流式细胞术检测细胞表面TRAIL受体的表达 |
| 2.1.4 Western blot检测DR5蛋白水平的表达 |
| 2.2 胞浆凋亡通路水平的检测 |
| 2.2.1 Western blot检测caspase3前体蛋白(procaspase 3)的表达 |
| 2.2.2 线粒体非依赖途径的检测 |
| 2.2.2.1 Western blot检测caspase 8前体蛋白(procaspase 8)的表达 |
| 2.2.2.2 FLIP表达水平的检测 |
| 2.2.3 线粒体依赖途径的检测 |
| 2.2.3.1 Western blot检测caspase 9前体蛋白(procaspase 9)的表达 |
| 2.2.3.2 Western blot检测Bid分子的活化 |
| 2.2.3.3 Bax表达水平的检测 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.HBc可降低DR5 mRNA和蛋白水平的表达 |
| 1.1 半定量和荧光定量PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 |
| 1.2 流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 1.3 Western blot检测DR5蛋白水平的表达 |
| 2.HBc抑制TRAIL诱导的procaspases-3,8,9及Bid的降解 |
| 2.1 Western blot检测Caspase 3活化水平 |
| 2.2 线粒体非依赖途径 |
| 2.2.1 Western blot检测Caspase 8活化水平 |
| 2.2.2 FLIP表达水平检测 |
| 2.3 线粒体依赖途径 |
| 2.3.1 Western blot检测Caspase9活化水平 |
| 2.3.2 Western blot检测Bid活化水平 |
| 2.3.3 Bax表达水平检测 |
| 讨论 |
| 第五章 HBc表达抵抗TRAIL诱导凋亡的分子机制研究(体内) |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1 |
| 2.2 小鼠尾静脉高压注射法建立体内实验模型 |
| 2.3 小鼠肝脏DR5表达水平检测 |
| 2.4 Western blot检测小鼠肝细胞Procaspase3,8,9及其Bid的表达 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.HBc下调肝细胞DR5的表达 |
| 1.1 流式细胞术检测DR5蛋白质水平的表达 |
| 1.2 Western blot检测DR5蛋白水平的表达 |
| 1.3 免疫组织化学检测小鼠肝组织DR5表达 |
| 2.HBc下调小鼠肝细胞Procaspase3,8,9及其Bid的活化水平 |
| 讨论 |
| 第六章 HBc对DR5启动子活性的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 试剂盒大量提取质粒pcDNA3-HBc、pGL3-basic、pDR5PF |
| 2.2 双荧光素酶报告基因系统检测HBc对DR5启动子活性的影响 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| HBc抑制DR5启动子活性 |
| 讨论 |
| 第七章 临床标本检测HBc与DR5表达的相关性研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 生物试剂 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 血清标本 |
| 1.4 肝切片标本 |
| 2.方法 |
| 2.1 ELISA检测慢性乙肝患者血清中HBc表达 |
| 2.2 ELISA检测慢性乙肝患者和正常对照者血清中sDR5表达 |
| 2.3 免疫组织化学方法检测慢性乙肝患者和正常对照者肝细胞DR4、DR5的表达 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.慢性乙肝患者血清中HBc表达 |
| 2.慢性乙肝患者血清中sDR5表达水平降低 |
| 3.慢性乙肝患者肝细胞DR5表达水平降低 |
| 讨论 |
| 第八章 利用基因芯片分析HBc转染前后基因表达谱的变化 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞培养 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 生化试剂和试剂盒 |
| 1.4 主要的仪器设备及其它 |
| 2.方法 |
| 2.1 组织RNA的提取 |
| 2.2 RNA纯化与质检 |
| 2.3 质检合格RNA送检 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.5 差异表达基因的Real-time PCR验证 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.RNA定量与质控 |
| 2.基因芯片差异表达结果分析 |
| 3.Real-time PCR验证差异表达的基因 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 乙肝病毒截短型中蛋白【MHBS(t)】影响TRAIL诱导肝细胞凋亡的机制探讨 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞和细胞培养 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 生化试剂和试剂盒 |
| 2.方法 |
| 2.1 Western blot检测细胞外调控蛋白激酶2(ERK2)的活化 |
| 2.2 TUNEL流式细胞术检测PD98059抑制ERK2活化对MHBs(t)上调TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 2.3 Western blot检测PD98059封闭ERK2对凋亡通路分子的影响 |
| 结果 |
| 1.MHBs(t)增强ERK2的活化 |
| 2.抑制ERK2活化可逆转MHBs(t)对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 3.抑制ERK2活化可逆转MHBs(t)对凋亡通路分子的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图(FIGURES) |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表论文、论着目录及所获荣誉 |
| 一、主要发表及已录用论文 |
| 二、会议交流论文 |
| 三、参编论着 |
| 四、获得荣誉 |
| 五、成果鉴定及报奖 |
| 六、已发表及待发表英文论文全文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）uPA及V-ATPase在肝细胞癌的表达及其与浸润转移的关系（论文提纲范文）
| 一、英文缩写一览表 |
| 二、论文摘要 |
| 1.中文摘要 |
| 2.英文摘要 |
| 三、论文正文 |
| 前言 |
| 第一部分 uPA、MMP-9、V-ATPase在肝癌组织中表达的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 uPA与肝癌转移关系的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三部分 V-ATPase与肝癌转移关系的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 全文讨论 |
| 全文总结 |
| 本研究的创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 四、文献综述 |
| 五、攻博期间发表论文 |
| 六、致谢 |
（9）乙型肝炎病毒基因组的垂直传递及其突变与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 乙型肝炎病毒(HBV)及其基因组的生物学特性 |
| 1.1 HBV 及其基因组 |
| 1.2 HBV 基因组的生物学特性 |
| 2. HBV 感染的嗜肝性和泛嗜性 |
| 3. HBV 感染的传播方式 |
| 3.1 母婴传播 |
| 3.2 宫内感染 |
| 3.3 分娩期感染 |
| 3.4 产后感染 |
| 4. 乙肝的遗传学研究进展 |
| 4.1 遗传流行病学研究进展 |
| 4.2 细胞遗传学研究进展 |
| 4.3 分子遗传学研究进展 |
| 5. HBV 基因组通过生殖细胞进行垂直传递的研究 |
| 5.1 HBV 基因组通过精子垂直传递的研究 |
| 5.2 HBV 基因组通过卵子垂直传递的研究 |
| 6. 问题和展望 |
| 第二章 HBV 基因组在乙肝患者睾丸组织中的表达与父子间单核苷酸多态性分析 |
| 1 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 研究对象与材料 |
| 2.2 实验试剂与试剂成分 |
| 2.3 常用实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 HBV 基因组U5 样序列的检测 |
| 3.2 HBF 及其HBFa 和 HBFb HBV 感染率 |
| 3.3 PCR-SSCP 分析 |
| 3.4 HBV 基因组U5 样序列SNP 分析 |
| 3.5 HBF 睾丸及附睾石蜡包埋组织HBV 基因组PCR 检测 |
| 3.6 巢式PCR 扩增阳性的HBF 睾丸及附睾组织原位杂交结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 乙肝的遗传流行病学分析 |
| 4.2 血清游离型HBV 基因组检测与垂直传递 |
| 4.3 PBMC 整合型HBV 基因组检测与垂直传递 |
| 4.4 HBV 基因组的PCR-SSCP 突变分析与突变的垂直传递 |
| 4.5 HBV 基因组的SNP 分析与SNP 的垂直传递 |
| 4.6 HBF 睾丸及附睾组织HBV 基因组的存在 |
| 4.7 FISH 技术对HBV 基因组在组织细胞内的准确定位 |
| 第三章 HBV 基因组在乙型肝炎患者卵巢组织中的表达与垂直传递 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 试剂与器材 |
| 2.3 器材及来源 |
| 2.4 方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 HBM 卵巢组织HBsAg 的表达 |
| 3.2 孕妇卵泡组织及其新生儿脐带血HBV 基因组的PCR 扩增 |
| 3.3 HBM 的卵巢石蜡切片FISH 检测 |
| 3.4 HBM 卵巢组织与卵泡细胞HBV 基因组表达的免疫组化检测结果的统计学分析 |
| 3.5 HBM 卵泡及新生儿脐带血HBV 基因组PCR 方法检测结果的统计学分析 |
| 3.6 HBM 卵泡组织FQ-PCR 检测HBV 基因组 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 HBsAg 在卵巢组织的表达 |
| 4.2 HBM 母子间的HBV 基因组的垂直传递 |
| 4.3 研究HBV 基因组经卵细胞垂直传递的意义 |
| 第四章 HBV 基因组小鼠卵细胞载体的构建 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 器材及其来源 |
| 2.4 方法 |
| 2.5 实验结果的统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠单个卵细胞的分离及透明带的消化 |
| 3.2 小鼠卵细胞中HBV 基因组检测结果 |
| 3.3 转染小鼠卵细胞内及卵巢组织中 HBV 基因组检测结果的统计学分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 小鼠卵细胞俘获HBV 基因组 |
| 4.2 HBV 基因组通过小鼠卵细胞垂直传递 |
| 第五章 HBV 基因组小鼠精细胞载体的构建及转基因小鼠的垂直传递 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠精细胞俘获HBV 基因组的检测 |
| 3.2 小鼠精子俘获外源HBV 基因组的原位杂交检测 |
| 3.3 提取幼鼠尾DNA，检测HBV 基因组 |
| 3.4 检测转基因小鼠HBV RNA 的表达 |
| 3.5 HBV 检测结果的统计学分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 小鼠精细胞对外源基因具有主动捕获性 |
| 4.2 体外转染外源PBR322-HBV DNA 进入鼠精细胞 |
| 4.3 PCR 和FISH 方法检测精子捕获外源HBV 基因组 |
| 4.4 经输精管及附睾管内精子细胞转染法建立HBV 基因组垂直传递的小鼠模型 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文、着作 |
| 致谢 |
（10）乙型肝炎病毒母婴传播高危因素的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
四、链酶卵白素-生物素法检测乙型肝炎产妇分娩的死胎肝组织中乙型肝炎病毒及其标志物的研究（论文参考文献）
- [1]人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学研究[D]. 赵月. 中国农业大学, 2014(03)
- [2]家族聚集性肝细胞肝癌组织中 S 期激酶相关蛋白 2 和增殖细胞核抗原的表达及意义[J]. 潘楚芝,颜见,李裕军,陈骋,邓美海,林楠,许瑞云. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2013(04)
- [3]HBV宫内感染体外模型的构建及cAMP调控子宫肌细胞COX-2表达的机制研究[D]. 陈黎. 第三军医大学, 2011(07)
- [4]DEC1在原发性肝细胞性肝癌中的表达及其临床意义[D]. 石晓红. 山东大学, 2011(12)
- [5]乙型肝炎病毒表面抗原在人卵母细胞和早期胚胎中的表达[D]. 吴国英. 浙江大学, 2008(11)
- [6]DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用[D]. 陈宗艳. 四川农业大学, 2008(01)
- [7]乙肝病毒核心抗原和截短型中蛋白对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制研究[D]. 杜娟. 山东大学, 2008(12)
- [8]uPA及V-ATPase在肝细胞癌的表达及其与浸润转移的关系[D]. 廖芝玲. 广西医科大学, 2007(10)
- [9]乙型肝炎病毒基因组的垂直传递及其突变与表达[D]. 王培林. 中国海洋大学, 2007(03)
- [10]乙型肝炎病毒母婴传播高危因素的研究[D]. 薛璐. 天津医科大学, 2005(07)