一、PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌（论文文献综述）
武喜艳[1]（2020）在《新疆古代致病菌基因组学与进化历史研究》文中认为致病菌是指能侵入宿主并引起宿主感染的一类微生物,其包括细菌、病毒、螺旋体、真菌等。据2017年世界卫生组织统计,每年有超过数百万人因感染致病菌死亡。尽管致病菌有很久的历史,伴随着人类的起源而进化。但直到现在,很多致病菌的基因组结构、致病机制、宿主适应以及进化历史等都是不太清楚的。古DNA具有很大的潜力来研究古代的致病菌,理论上来说,在宿主死亡后,任何能侵入血液系统或硬组织的致病菌都可能在骨骼残骸上留下痕迹。通过对DNA的检测可用于鉴定感染的致病菌和可能的死亡原因。此外古DNA具有时间戳的特征,能校准分子钟用于研究致病菌的进化历史。更重要的是,通过构建古代致病菌的基因组能在基因组水平与现代致病菌进行比较基因组学研究,能够推测致病毒力进化过程以及宿主适应过程。因此,研究古代致病菌具有很重要的意义。在中国历史上,有多次致病菌的记载,在古代殷墟甲骨文已有「虫」、「蛊」、「疟疾」、「疾年」等文字的记载。根据张志斌先生统计的中国古代疫病流行年表,可以看出至少有上千次的疫病发生在古代中国。这些疫病是什么致病菌引起的以及怎么传播的至今仍然是未解之谜。新疆地处欧亚大陆的交通要道,东西方文明曾在这里碰撞,同时也是丝绸之路的必经之地。频繁的人群交流促进了致病菌的传播。因此,研究中国新疆地区的致病菌对于了解东西方人群的交流以及追溯致病菌的起源和传播都有重要的意义。DNA测序技术的进步,使得对古代遗骸中的人和微生物进行全基因组测序成为可能。获得的古代样本全基因组数据中不仅包含人类的基因组信息还有大量来自于环境中的微生物以及少量的致病菌信息。如何检测这些致病菌是一个重要的挑战。为了找到合适的致病菌筛查工具,本研究对比了多种宏基因组工具,从不同角度考量了适用于古代致病菌研究的工具。通过比较后,本研究选出了最合适的筛查方案,并构建了致病菌筛查数据库。本研究对新疆泉儿沟遗址、石人子沟遗址、阿拉沟遗址、鱼儿沟遗址、库车遗址共48例样本进行致病菌筛查,从而在泉儿沟遗址中发现了引起肠炎的沙门氏菌。这表明至少在3000年前在新疆已经出现了沙门氏菌流行病。该发现可能为泉儿沟遗址中未成年个体高死亡率的现象提供了一种可能的解释,此外,这项研究填补了古致病菌基因组研究在中国的空白。为获得高质量的致病菌基因组用于下游分析,本研究自主设计探针,包含了沙门氏菌的各个亚型,去除同源性序列,去除高GC区域,探针长度设为100bp,最后共设计了 92710条探针。研究采用液相探针富集的方法对筛查到的沙门氏菌进行靶向富集,得到了 6个古代沙门氏菌基因组序列。研究分析了探针的有效性,比较了捕获前后的内源沙门氏菌DNA含量的变化,捕获效率约达到35-274倍。将这些古代基因组和现代沙门氏菌基因组进行系统发育分析,发现我们的古代样本大多聚在一起,古代样本所处的分支属于现代丙型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和猪伤寒沙门氏菌的祖先分支,这些分支被称为Para C谱系。本研究进一步选取了基因组覆盖率达到3X以上的两个个体XBQM90和XBQM20进行下游分析。本研究重新构建了沙门氏菌Para C谱系并对沙门氏菌的每个致病岛（Salmonella Pathogenicity Islands简称为SPI）进行了研究,我们发现SPI-6和SPI-7在古代样本和现代样本中有明显的差异。本研究将沙门氏菌确认出现SPI-7的时间提前到了 3000年前。微生物宿主适应与假基因的累积有关,本研究基于基因组中终止密码子提前和移码突变的出现计算了古代沙门氏菌的假基因频率,通过比较无宿主适应性的沙门氏菌和强宿主选择性的沙门氏菌的假基因频率,结合古代沙门氏菌所处的系统发育位置,从而得出古代的沙门氏菌属于人猪共患类型。结合了新疆历史时期人群驯养动物的情况,该地区并没有猪的出现,进一步说明这些沙门氏菌可能来源于别的区域。为深入探究欧亚大陆致病菌的进化模式和传播历史。本研究进一步探究了新疆地区泉儿沟遗址的人群来源,主成分分析、f3检验、f4检验和Admixture分析以及qpAdm分析均表明新疆泉儿沟遗址人群属于欧亚大陆东西方谱系的混合人群,西部谱系的来源应是欧亚西部的草原人群。结合已发表数据,欧亚草原西部新石器晚期和青铜早期的沙门氏菌在系统发育的位置上属于本研究古代菌株的祖先分支,我们推测新疆泉儿沟遗址发现的沙门氏菌可能由草原人群迁移带来的。将来,有必要从不同时间段和不同地理区域对骨骼材料进行进一步采样,开展更多的古代致病菌筛查,这将有助于增进我们对肠炎沙门氏菌传播的了解。
王二龙[2]（2019）在《斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究》文中认为渔用疫苗作为替代抗生素和化学药物进行鱼类细菌性疾病防治更为安全有效的防治方法,得到了世界各国的广泛重视。多联疫苗因其可预防多种疾病、减少接种次数、简化免疫程序等特点,已成为当今世界疫苗的研究和发展方向。鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）和鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）作为近年来斑点叉尾鮰养殖频发的两种细菌性疾病病原,给我国斑点叉尾鮰乃至整个水产养殖业的健康发展造成了严重危害。本研究以斑点叉尾鮰源E.ictaluri外膜蛋白OmpN2和Y.rucker外膜蛋白OmpF为研究对象,在对其进行分子克隆、生物信息学分析、原核表达和免疫原性分析基础上初步研究其作为疫苗候选目的抗原的潜力。通过添加多肽Linker接头序列、酶切连接、融合基因技术等分子生物学手段构建二联融合基因N2-F,通过分子克隆和原核表达制备二联基因N2-F亚单位疫苗。此外,采用海藻酸钠-壳聚糖等天然高分子复合物作为包被材料,研制二联基因N2-F口服微球疫苗,分别以腹腔注射和拌饲口服方式将二联基因N2-F亚单位疫苗和口服疫苗免疫接种斑点叉尾鮰,通过特异性抗体水平、非特异性免疫指标、免疫相关基因的表达和相对免疫保护率等方面综合评价其免疫保护效果并初步探讨其免疫保护机制,为生产上开发安全有效的多联疫苗,进行斑点叉尾鮰的鮰爱德华氏菌病和鲁氏耶尔森氏菌病的免疫防治提供参考。本研究具体内容包括以下几个方面:1.OmpN2与OmpF基因的分子克隆与生物信息学分析通过对鮰爱德华氏菌外膜蛋白OmpN2基因和鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白OmpF基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行全面的分子特性分析和抗原表位预测,结果发现OmpN2和OmpF基因序列全长分别为1122 bp和1095 bp,分别编码373和364氨基酸序列,均具有革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,分别属于E.ictaluri和Y.rucker外膜孔蛋白,分别具有9个和12个潜在抗原决定簇区域,两者氨基酸序列相似性为65.96%,三维结构预测显示均为三聚体的空间构象,均与同一个模板有60%以上的相似性,表明两者在结构和功能上有一定的相似性,推测其作为疫苗候选抗原可能提供一定的交叉保护作用。2.OmpN2与OmpF的原核表达与免疫原性分析通过体外原核表达技术,成功诱导表达了去除信号肽后的目的重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF,大小分别约为56 kDa和55 kDa;细菌表面显色技术和间接免疫荧光分析显示,E.ictaluri和Y.ruckeri能分别与兔抗rtOmpN2抗体和兔抗rtOmpF抗体发生特异性结合反应,显示显示阳性反应信号,表明OmpN2和OmpF蛋白分别位于E.ictaluri和Y.ruckeri的菌体表面,是一种细菌表面抗原。Western bloting分析显示,rtOmpN2蛋白和rtOmpF蛋白能分别被兔抗E.ictaluri和兔抗Y.ruckeri抗体识别并发生特异性反应,表明OmpN2和OmpF蛋白不仅是E.ictaluri和Y.ruckeri的抗原之一,且具有良好的免疫原性,可用作基因工程疫苗候选目的抗原。3.融合基因N2-F的构建,分子克隆,原核表达与免疫原性分析;通过添加多肽Linker接头序列和BamH I酶切位点连接法成功构建了N2-F融合基因,大小为2133 bp;通过体外原核表达,成功诱导表达了重组融合蛋白N2-F,大小约为96 kDa;Western blotting分析显示,N2-F能分别与兔抗6×His抗体、兔抗E.ictaluri抗体和兔抗Y.ruckeri抗体发生特异性反应,显示单一、明显条带,表明融合蛋白N2-F融合表达成功,且同时具有OmpN2和OmpF的蛋白构象,能被相应的抗体识别;细菌表面显色分析显示,E.ictaluri和Y.ruckeri均能与兔抗N2-F抗体发生特异性结合反应,显示阳性反应信号,表明融合蛋白N2-F同时具有OmpN2和OmpF的免疫原性,可用作研制同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的二联基因工程疫苗候选抗原。4.二联基因N2-F亚单位疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析与单价疫苗rtOmpN2和rtOmpF相比,二联疫苗N2-F分别显着性（P<0.05）增强了斑点叉尾鮰相应的血清抗体水平及血清溶菌酶、补体C3、总蛋白含量、SOD活性等非特异性免疫指标,提高了头肾和脾脏中免疫相关基因的表达量,对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的相对保护率（Relative Percent Survival,RPS）分别为76.67%和82.71%,均高于rtOmpN2（RPS为73.33%）和rtOmpF（RPS为75.86%）,表明N2-F不仅能同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri两种病原菌的感染,还提供了更高更好的免疫保护效果。5.二联基因口服微球疫苗的制备、条件优化及理化特性分析采用响应面分析法优化了海藻酸钠-壳聚糖复合微球的制备工艺,得到最优制备条件为:海藻酸钠浓度为1.58%,水油相比例为4.0:6.0,CaCl2浓度为8.60%,壳聚糖溶液浓度为0.82%,在此条件下,重组蛋白N2-F海藻酸钠壳聚糖复合微球疫苗的包封率为93.26%,粒径为4.35±1.08μm。通过对复合微球的理化性质进行分析发现,N2-F复合微球对溶液的温度,pH和离子强度均有不同程度的敏感性,在温度较高,碱性环境以及离子强度较高的溶液中,溶胀性增强;通过体外模拟胃肠液环境分析复合微球的释放性能,发现微球能在模拟胃液（酸性环境）中释放缓慢,在模拟肠液（碱性环境）中释放速率较快,既能保护目的蛋白在胃部不被胃酸降解破坏,又能保证目的蛋白在肠道释放以供吸收;通过Western blotting检测显示,复合微球释放的蛋白为目的蛋白抗原,且保持了良好的免疫原性。安全性检测表明复合微球的安全性好,可用作鱼用口服疫苗。6.二联基因口服疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析与单基因rtOmpN2和rtOmpF口服疫苗相比,二联基因N2-F口服疫苗分别显着性（P<0.05）增强了斑点叉尾鮰免疫后肠黏液和血清中相应的抗体水平及溶菌酶、补体C3、总蛋白含量、SOD活性等非特异性免疫指标,提高了头肾和脾脏中免疫相关基因的表达量,对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的相对保护率分别为73.33%和79.31%,分别高于rtOmpN2微球疫苗组（RPS为63.33%）和rtOmpF微球疫苗组（RPS为65.52%）,表明二联基因N2-F口服疫苗不仅能同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri两种病原菌的感染,还提供了更好的免疫保护效果。综上,通过构建二联基因N2-F,分别制备了二联基因N2-F亚单位疫苗和N2-F口服疫苗,分别以腹腔注射和拌饲口服方式免疫接种斑点叉尾鮰综合分析和评价其相应的免疫保护效果,结果显示,两种疫苗对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染均取得理想的免疫保护效果,表明本研究制备的二联基因N2-F亚单位疫苗和N2-F口服疫苗能有效增强斑点叉尾鮰的免疫能力,对抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri的感染起到较好的免疫防御和保护效果。其中二联基因亚单位疫苗的保护效果略优于二联基因口服疫苗,但结合水产养殖生产实践,口服免疫接种的二联基因口服疫苗更易被认可和接受。
李子微[3]（2019）在《LAMP和RealAmp技术检测四种细菌性生物战剂的研究》文中研究表明目的:土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis,FT）、类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,BP）、布鲁氏菌（Brucella,Bru）和鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis,YP）均具有高度致病性和传染性,是重要的生物战剂,对人类的健康、甚至生存,构成极大的威胁。本研究旨在建立一种快速、准确可靠及易于推广的检测技术,以防范和应对以上细菌可能造成的生物恐怖威胁。方法:本研究基于环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）和实时荧光环介导等温扩增技术（real-time fluorescence loop-mediated isothermal amp Jlification,Real Amp）,分别建立并优化本研究中所涉及细菌的检测体系。针对Fop A基因设计LAMP引物,检测土拉弗朗西斯氏菌;针对Fli C基因设计LAMP引物,检测类鼻疽伯克霍尔德菌;针对Omp25基因设计LAMP引物,检测布鲁氏菌;针对F1基因设计LAMP引物,检测鼠疫耶尔森氏菌。以同源性较高的菌株基因组DNA作为模板,评价检测体系的特异性;采用目标菌的基因组DNA和质粒作为模板,评价检测体系的灵敏度。以质粒菌污染环境土壤制备模拟样本,评价检测体系在实际环境中的检出限和应用价值,并与行内认可的实时荧光定量PCR试剂进行平行比对检测实验,评价检测体系的准确度和检测率。结果:（1）筛选出土拉弗朗西斯氏菌FopA基因、类鼻疽伯克霍尔德菌Fli C基因、布鲁氏菌Omp25基因和鼠疫耶尔森氏菌F1基因分别建立了环介导等温扩增技术和实时荧光环介导等温扩增技术,并优化反应条件和体系;（2）以其他非目标菌菌株基因组DNA和蜱虫基因组总DNA为模板,未出现非特异性扩增;（3）以土拉弗朗西斯氏菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达4.9×102 cfu/m L和4.9×101 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达8 copies/μL和5 copies/μL;以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达1×103 cfu/m L和1×102 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达1×102 copies/μL和1×101 copies/μL;以布鲁氏菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达1×102 cfu/m L和1×101 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达1×101 copies/μL和8 copies/μL;以鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达1×104 cfu/m L和1×103 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达1×101 copies/μL和8 copies/μL;（4）分别采用土拉弗朗西斯氏质粒菌、类鼻疽伯克霍尔德菌质粒菌、布鲁氏质粒菌和鼠疫耶尔森氏质粒菌污染环境土壤建立模拟样本,除了LAMP检测鼠疫耶尔森氏质粒菌的检出限为44 cfu/g外,LAMP和Real Amp对其他质粒菌的检出限均可达4.4 cfu/g;且与实时荧光定量PCR试剂平行对比检测含高、中、低浓度（4.4×101 cfu/g4.4×108 cfu/g）共24份土壤模拟样本,结果与预期一致。结论:本研究建立的土拉弗朗西斯氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、布鲁氏菌和鼠疫耶尔森氏菌的环介导等温扩增技术,特异性强、灵敏度高,仪器简便、成本低廉,反应时间较短,1 h即可完成,易于基层的推广使用;而实时荧光环介导等温扩增技术灵敏度更,2040min即可查看扩增结果,简便快速;两种检测技术与实时荧光定量PCR试剂平行对比检测模拟样本,准确率和检出率均能保持持平,有望为临床诊断、环境污染检测、应对生物恐怖威胁和维护公众安全等方面提供有效、可靠的快速检测手段。
叶成林[4]（2019）在《鼠伤寒沙门氏菌致病机制的研究》文中研究说明【背景与目的】鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是导致肠道感染的重要人畜共患病原菌,是一种革兰氏阴性杆菌。鼠伤寒沙门氏菌主要通过污染的食物或水经粪口传播,经胃入肠后,在肠道内增殖,粘附于肠黏膜上皮细胞,进而侵入固有层,引起的症状轻至肠炎重至败血症和全身系统性播散引起的内脏损害。然而,鼠伤寒沙门氏菌在宿主体内播散的分子机制尚待进一步确定。有研究表明HIV的播散机制是通过与人抗原提呈细胞上表达的C型凝集素受体DC-SIGN（CD209a）相结合,从而劫持抗原提呈细胞促进病毒的播散。我们前期的研究发现,敲除脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）O抗原表达基因的鼠伤寒沙门氏菌突变株,暴露出核心寡糖后也可以与DC-SIGN（CD209a）相结合。但野生型的鼠伤寒沙门氏菌O抗原覆盖了其核心脂多糖。在本研究中,我们通过被巨噬细胞吞噬后失去O抗原的鼠伤寒沙门氏菌与CD209的相互结合侵袭抗原提呈细胞,以及观察鼠伤寒沙门氏菌播散至小鼠的局部淋巴结、脾脏、肝脏的情况,进而证明鼠伤寒沙门氏菌能像HIV一样,可以通过与CD209的相结合,利用抗原提呈细播散至淋巴结、脾脏和肝脏,从而引起宿主感染。【方法】1.体外实验检测经巨噬细胞RAW264.7吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白Pgt E的纤维蛋白溶酶原激活功能用小鼠巨噬细胞样细胞系RAW264.7吞噬鼠伤寒沙门氏菌后裂解得到释放的鼠伤寒沙门氏菌LT2（ST-treated）,通过纤维蛋白溶酶原激活物活性比色法检测ST-treated和未被处理过的鼠伤寒沙门氏菌LT2（ST）的Pgt E对纤维蛋白溶酶原的活化作用。2.体外实验检测经巨噬细胞吞噬后释放的和未处理过的鼠伤寒沙门氏菌对人和鼠的抗原提呈细胞的侵袭能力1)纯化人肠道组织中的树突状细胞,用ST-treated和ST侵袭人肠道树突状细胞,表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护法检测侵袭能力。2)将表达绿色荧光蛋白的质粒p Ac GFP1转入鼠伤寒沙门氏菌,用ST-treated和ST侵袭小鼠腹腔巨噬细胞,表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护实验和流式细胞术检测侵袭能力。3.体外实验检测经巨噬细胞吞噬后释放的和未处理过的鼠伤寒沙门氏菌对CHO、CHO-m SIGNR1以及CHO-h DC-SIGN的侵袭能力用ST-treated和ST侵袭CHO、CHO-m SIGNR1以及CHO-h DC-SIGN稳转细胞,26℃孵育的假结核耶尔森菌、表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护法检测侵袭能力。4.细胞侵袭抑制实验用甘露寡糖与CHO-m SINR1和CHO-h DC-SIGN稳转细胞孵育,加入ST-treated,以26℃孵育的假结核耶尔森菌和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护法检测侵袭能力。5.动物体内感染实验检测细菌在体内的播散将质粒p BR322和表达O抗原的质粒p AY100.1转入鼠伤寒沙门氏菌,通过灌胃途径感染C57BL/6J小鼠,4天后取小鼠脏器研磨,观察细菌在小鼠体内播散情况。6.动物体内感染实验检测小鼠生存率1)通过灌胃途径,用携带p BR322的鼠伤寒沙门氏菌（ST-p BR322）和携带p AY100.1的鼠伤寒沙门氏菌（ST-p AY100.1）,观察小鼠存活率。2)ST-p BR322灌胃感染给予甘露寡糖或未给予甘露寡糖的C57BL/6J小鼠,观察细菌对小鼠存活率的影响。3)通过腹腔注射途径,用ST-p BR322和ST-p AY100.1感染C57BL/6J小鼠,观察细菌对小鼠存活率的影响。【结果】1.经巨噬细胞系RAW264.7吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌会暴露其核心寡糖鼠伤寒沙门氏菌拥有外膜蛋白PgtE,然而其激活纤维蛋白溶酶原的功能受到O抗原的抑制。鼠伤寒沙门氏菌经过巨噬细胞系RAW264.7处理后,Pgt E具有激活纤维蛋白溶酶原的活性。p AY100.1在鼠伤寒沙门氏菌中可以稳定表达O抗原,转入质粒p AY100.1的鼠伤寒沙门氏菌无论是否经巨噬细胞吞噬后释放,Pgt E活性均较低,说明巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌会暴露其核心寡糖。2.经巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌具有更强的侵袭人和小鼠的抗原提呈细胞的能力经过巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌暴露核心寡糖后,我们检测它和抗原提呈细胞之间的相互作用。实验表明,ST-treated比ST对小鼠原代腹腔巨噬细胞和人肠道固有层树突状细胞的侵袭能力更强。说明经巨噬细胞吞噬后,暴露核心寡糖的鼠伤寒沙门氏菌侵袭人和小鼠抗原提呈细胞的能力更强。3.人的DC-SIGN（h DC-SIGN）和小鼠的SIGN-R1（m SIGN-R1）是巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌的受体用ST-treated和ST侵袭表达h DC-SIGN（h CD209a）的稳转细胞（CHO-h DC-SIGN）和表达m SIGN-R1（m CD209b）的稳转细胞（CHO-m SIGN-R1）以及不表达受体的CHO细胞,沙门氏菌对表达受体的CHO侵袭力更强,而ST-treated比ST对CHO-h DCSIGN和CHO-m SIGN-R1侵袭能力强,说明人的h DC-SIGN和小鼠的m SIGN-R1是巨噬细胞处理后的鼠伤寒沙门氏菌侵袭人和小鼠抗原提呈细胞的受体。4.CD209介导的鼠伤寒沙门氏菌对细胞的侵袭会被甘露寡糖所抑制加入甘露寡糖后,巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌对CHO-h DC-SIGN的侵袭力显着降低,而对CHO-m SIGNR1的侵袭途径影响不显着,说明甘露寡糖可以抑制CHO-h DC-SIGN与巨噬细胞处理过的鼠伤寒沙门氏菌之间的相互结合,且h DCSIGN（h CD209a）和m SIGN-R1（m CD209b）在和鼠伤寒沙门氏菌的相互作用中有所区别。5.稳定表达的O抗原抑制鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的播散用稳定表达O抗原的鼠伤寒沙门氏菌ST-p AY100.1和只携带空载质粒的鼠伤寒沙门氏菌ST-p BR322通过灌胃途径感染小鼠后,对小鼠脏器内的细菌数目进行计数,ST-p AY100.1组小鼠脏器的菌量明显低于ST-p BR322组,表明稳定表达的O抗原会抑制鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的播散。6.稳定表达的O抗原和甘露寡糖均能降低鼠伤寒沙门氏菌的感染能力感染ST-p AY100.1的小鼠存活率明显高于感染ST-p BR322的小鼠,用ST-p BR322感染给予或未给予甘露寡糖的小鼠后,给予甘露寡糖的小鼠存活率显着高于未给予甘露糖的小鼠。说明O抗原的表达和甘露寡糖均能降低鼠伤寒沙门氏菌的感染力。【结论】本研究证明鼠伤寒沙门氏菌侵入宿主后暴露核心寡糖,通过结合CD209来劫持抗原提呈细胞从而促进其在宿主体内的播散。【背景与目的】鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis,简称鼠疫菌）可以引起典型的自然疫源性烈性传染病鼠疫（Plague）,根据传播途径不同,可引起腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。鼠疫菌是由肠道病原菌假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）进化而来,假结核耶尔森氏菌引起的只是温和的肠道自限性腹泻,而在进化过程中获得质粒p PCP1和质粒p MT是假结核耶尔森氏菌进化为致死性鼠疫菌的重要环节。p PCP1可以编码三种蛋白,其中的pla基因编码外膜蛋白纤维蛋白溶酶原激活物（plasminogen activator,Pla）是目前为止鼠疫菌感染中唯一的毒力因子,并且在进化过程中鼠疫菌获得pla后才具有引起肺鼠疫的能力。Pla可以裂解纤溶酶、α2-抗纤溶酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1等,降解补体C3成分。我们前期的实验研究发现Pla可以利用宿主细胞表面的C型凝集素受体m DEC205（CD205）介导细菌的侵袭和播散。研究发现尽管Pla并非为败血症鼠疫所必须,但是在腺鼠疫中Pla可以激活宿主纤维蛋白溶解系统,从而促进鼠疫菌的播散。在肺鼠疫中,Pla对细菌在肺部的大量繁殖起到重要作用。因此,Pla是腺鼠疫和肺鼠疫感染中重要的毒力因子。而pla在鼠疫菌进化过程中的来源仍然不明确。Pla和肠道病原菌鼠伤寒沙门氏菌的毒力因子Pgt E同属于外膜蛋白家族,它们有各自的降解底物,但功能上有非常高的相似性,O抗原的缺失都加强其纤溶酶原激活作用和侵袭力。不仅如此,根据pla和pgtE的基因测序以及Pla和Pgt E的氨基酸序列分析,Pla和Pgt E的编码基因同源性达69%,蛋白质同源性达75%。结合对于pla与pgtE基因序列和编码蛋白氨基酸序列的研究,我们推测肠道致病菌假结核耶尔森氏菌在进化为鼠疫菌的过程中获得的pla可能与同为肠道病原菌鼠伤寒沙门氏菌的pgtE有关。本研究拟通过将鼠伤寒沙门氏菌pgtE转入鼠疫菌后,检测其激酶活性和与CD205结合后促进侵袭的能力,对宿主抗原提呈细胞的侵袭能力,模拟肺鼠疫感染途径观察重组鼠疫菌对小鼠的致病力,从而探讨是否鼠伤寒沙门氏菌的pgtE与鼠疫菌的pla相似,其编码蛋白能通过结合CD205来促进鼠疫菌的感染,为两者的关系提供新的证据。【方法】1.检测表达Pgt E的鼠疫菌纤溶酶原激活物活性将表达Pgt E和Pla的质粒分别转入鼠疫菌和大肠杆菌中,用纤维蛋白溶酶原激活物活性比色法检测Pgt E和Pla在鼠疫菌中的活性。2.检测表达Pgt E的大肠杆菌和鼠疫菌对肺泡巨噬细胞的侵袭能力用庆大霉素保护法检测E.coli-pla（表达Pla的大肠杆菌）、E.coli-pgtE（表达Pgt E的大肠杆菌）、1419-pla（表达Pla不表达Pgt E的鼠疫菌）、1419-pgtE（表达Pgt E不表达Pla的鼠疫菌）对小鼠肺泡巨噬细胞的侵袭能力,1419和1418为对照组。3.检测表达Pgt E的大肠杆菌和鼠疫菌对CHO-m DEC205稳转细胞的侵袭用庆大霉素保护法检测E.coli-pla、E.coli-pgtE、1419-pla、1419-pgtE对稳转细胞CHO-m DEC205的侵袭能力。表达O抗原的假结核耶尔森氏菌Y1、大肠杆菌DH5α、DH5α-pla（表达Pla）作为对照组。4.动物感染体内实验1)用转入表达质粒p SE380的野生型鼠疫菌91001p SE380、91001p PCP1--p SE380（敲除质粒p PCP1后转入p SE380的鼠疫菌）、91001p PCP1--pla（转入pla的91001p PCP1-）、91001p PCP1--pgtE（转入pgtE的91001p PCP1-）通过鼻内途径感染小鼠,模拟肺鼠疫途径,48小时后处死取组织器官,HE染色检测小鼠肺部炎症细胞浸润情况。2)用野生型鼠疫菌91001p SE380、91001p PCP1--p SE380、91001p PCP1--pla（转入pla的91001p PCP1-）、91001p PCP1--pgtE（转入pgtE的91001p PCP1-）通过鼻内途径感染小鼠,模拟肺鼠疫途径,观察小鼠的存活率。【结果】1.Pgt E在重组的鼠疫菌中仍具有激活纤维蛋白溶酶原的活性将表达Pgt E和Pla的质粒分别转入鼠疫菌和大肠杆菌后,用纤维蛋白溶酶原激活物活性比色法检测,重新转入pla的1419（鼠疫菌1418敲除p PCP1）和E.coli-pla纤维蛋白溶解酶原活化活性与未敲除p PCP1的1418接近,转入pgtE的1419活化作用虽然较慢,但与1419比较活性显着增加,说明Pgt E在鼠疫菌可以表达且其活性并未受到抑制。2.Pgt E介导重组大肠杆菌和鼠疫菌对小鼠肺泡巨噬细胞的侵袭取小鼠肺泡巨噬细胞,将pla和pgtE转入鼠疫菌和大肠杆菌后,用庆大霉素保护法检测发现E.coli-pgtE侵袭小鼠肺泡巨噬细胞的能力比E.coli显着增高,1419-pla、1419-pgtE侵袭肺泡巨噬细胞的能力显着高于1419。表明Pgt E同Pla一样可以介导重组大肠杆菌和鼠疫菌对小鼠肺泡巨噬细胞的侵袭。3.m DEC205是表达Pgt E的细菌侵袭细胞的受体E.coli-pgtE对表达小鼠DEC205的CHO细胞有较强的侵袭力,1419-pla、1419-pgtE对稳转细胞CHO-m DEC205的侵袭能力比1419显着增加。说明在细菌和细胞相互作用的过程中,m DEC205是表达Pgt E的细菌侵袭细胞的受体。4.Pgt E的表达促进鼠疫菌加剧小鼠肺部炎症细胞浸润91001p PCP1--pla、91001p PCP1--pgtE通过鼻内途径感染小鼠后,HE染色结果显示小鼠肺部炎症细胞浸润数量显着多于91001p PCP1--p SE380,说明Pgt E在鼠疫菌中和Pla一样促进鼠疫菌对小鼠肺部的炎症损伤。5.Pgt E的表达降低p PCP1敲除的鼠疫菌感染小鼠的生存率91001p PCP1--pla、91001p PCP1--pgtE通过鼻内途径感染小鼠后,小鼠的存活率显着低于91001p PCP1--p SE380感染的小鼠,说明Pgt E的表达增强了p PCP1质粒缺失鼠疫菌的致死率。【结论】本研究证明了Pgt E和Pla一样可以利用m DEC205侵袭宿主抗原提呈细胞,并促进鼠疫菌在宿主内的感染,引起肺部损伤,为鼠伤寒沙门氏菌的pgtE与鼠疫菌的pla之间的关系提供了新的证据。
张艳[5]（2018）在《云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义》文中研究说明目的了解云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的分布及其流行现状;完善三种致病耶尔森菌的PCR基因检测方法。方法1.样本采集:共选取云南省野鼠鼠疫疫源地和云南省家鼠鼠疫疫源地共11个地区,家鼠鼠疫疫源地包括:梁河县、宜良县、保山市、弥勒县、弥渡县、玉溪市、文山市;野鼠鼠疫疫源地包括:玉龙县、剑川县、洱源县、鹤庆县。捕鼠采用鼠铗法;同时采集部分家鼠鼠疫疫源地的犬类肛拭子。2.三种致病耶尔森氏菌筛查基因确定:通过对采集的部分样本进行实验,确定筛查三种致病耶尔森氏菌的目标基因。3.PCR初筛:将采取的鼠结盲肠部及其内容物和犬类肛拭子共4985份样本置于10mL改良磷酸盐缓冲液（PBS）中,4℃冷增菌15-21天后用其沉淀液提取DNA,并对foxA、inv、0392基因进行PCR筛查。4.细菌筛查:将初筛过程中PCR阳性样本接种在CIN琼脂平板上,于28℃条件下、24h培养,挑取可疑菌落对foxA、inv、0392基因进行细菌PCR筛查。5.保菌处理:对细菌筛查阳性样本,提取其DNA进行PCR检测并保存其纯菌样本,置于-80℃冰箱保存。6.对实验结果进行统计和分析:数据分析采用R×C列联表的χ2检验,使用SPSS17.0进行统计分析,检验水准P<0.05为有统计学差异。结果1.三种致病耶尔森氏菌筛查基因确定情况:2016年1-5月采集宜良、丽江、弥勒、弥渡四个地区1344份样本和其他菌株进行foxA、inv、F1、0392基因筛查。其中foxA、inv基因分别对筛查小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌筛查具有特异性,F1基因对筛查鼠疫耶尔森氏菌会出现非特异性条带,0392基因对鼠疫耶尔森菌筛查不会出现非特异性条带具有特异性,采用0392基因作为对鼠疫耶尔森菌筛查的目标基因。2.云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的分离情况:2016年1月至2017年10月,共采集云南省11个地区样本4985份样本,其中foxA阳性样本菌株共248株,分离为4.97%;初筛0392阳性样本6份,阳性率0.12%、初筛inv阳性样本0份。3.云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的统计学分析:云南省11个地区的三种致病耶尔森氏菌阳性率不完全相同（χ2=197.944,P<0.05）;其中0392基因统计分析P>0.05,无统计学意义。foxA阳性菌株（χ2=333.74,P<0.05）具有统计学差异。Inv均为阴性无差异。4.云南省部分鼠疫疫源地鼠类和犬类统计学分析:鼠类样本共4284份,犬类样本共701份。其中鼠类foxA阳性菌株有225株,分离率为4.97%。犬类肛拭子foxA阳性菌株有23株,分离率为3.28%,统计分析（χ2=4.95,P=0.024<0.05）具有统计学差异,即鼠类foxA阳性菌株分离率高于犬类肛拭子foxA阳性菌株分离率。5.云南省野鼠鼠疫疫源地和家鼠鼠疫疫源地统计学分析:云南省野鼠疫源地和家鼠疫源地foxA阳性菌株分离率不完全相同（χ2=164.51,P<0.05）,野鼠鼠疫疫源地的foxA阳性菌株分离率比家鼠鼠疫疫源地的分离率高。其中在野鼠鼠疫疫源地中玉龙县的foxA阳性菌株分离率比其他三个县的分离率高,在家鼠鼠疫疫源地以梁河县和弥勒县的foxA阳性菌株分离率较高。6.云南省部分鼠疫疫源地foxA阳性菌株在鼠类型分布情况:不同鼠类型的foxA阳性菌株分离率有差异（χ2=86.20,P<0.05）。其中家鼠鼠疫疫源地鼠类型主要是褐家鼠和黄胸鼠,野鼠鼠疫疫源地鼠类型主要是齐氏姬鼠、大绒鼠和中华姬鼠。对五种鼠类型进行两两比较:大绒鼠和齐氏姬鼠的foxA阳性菌株分离率要高于其他三种鼠的分离率,且foxA阳性菌株分离率主要分布在野鼠鼠疫疫源地,以齐氏姬鼠、大绒鼠为主。7.玉龙县和剑川县foxA阳性菌株分布情况:玉龙县鼠类样本共有853份,以南溪村委会旦后村foxA阳性菌株分离率最高。玉龙县的鼠类样本以大绒鼠foxA阳性菌株分离率要高于其他类型鼠类。剑川县样本包括鼠样本794份样本,foxA阳性菌株分离率较高地区主要集中在石龙村和长乐村。剑川县采集鼠类样本foxA阳性菌株分离率无统计学差异。结论1.云南省野鼠鼠疫疫源地小肠结肠炎耶尔森菌鼠类标本总体分离率高于家鼠鼠疫疫源地。2.在初筛疫源地现场标本或者处理鼠疫疫情时,使用鼠疫菌染色体上的特异基因如YPO0392上基因比在质粒上的F1基因进行PCR中更具说服力。3.在对疫源地的三种致病耶尔森菌监测中,可采用0392、foxA、inv三种目标基因进行组合筛查三种致病耶尔森菌。
冯娜[6]（2017）在《免疫磁珠捕获技术结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森氏菌的研究》文中认为鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）引起的一种烈性传染病,其具有传染性强、病死率高、传播速度快、自然疫源性等诸多特点。人类历史上,曾经发生过三次鼠疫大流行,引起数以亿计人死亡,给人类带来过沉重灾难。在我国,鼠疫被列为甲类传染病。随着现代医学技术的不断发展,鼠疫疫情虽已得到有效控制,但近年来,动物间鼠疫的流行区域不断扩大,人间鼠疫病例呈上升态势。与此同时,鼠疫菌作为一种典型的生物战剂及生物恐怖制剂,时刻威胁着人类的安全。由此可见,鼠疫的监控对人类健康安全、经济发展和社会稳定具有重要意义。众所周知,对鼠疫菌快速、有效的检测是控制其传染的重要手段。目前,对鼠疫菌的常规检测主要包括细菌学检测、免疫学检测、分子生物学检测等。细菌学检测一般分四步进行——显微镜镜检、细菌培养、鼠疫噬菌体裂解实验、动物实验。该方法耗时长、需要大量人力物力,不适用于鼠疫菌大量筛查及现场检测。分子生物学检测,即通过体外扩增特异性的核酸片段实现对鼠疫菌的检测,该方法虽然具有快速、灵敏、特异等优点,但其往往需要特定仪器才能进行,且价格昂贵,操作不便。因此,不适用于偏远地区实验室及野外检测。免疫学方法是一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法,主要以胶体金、酶联免疫吸附实验等方法为代表。这些方法具有操作简便、安全性高、特异性好且灵敏度高等优点,但在检测前一般都需要进行增菌培养,耗费大量时间,并且该方法抗干扰能力较差。因此,建立一种可快速、高效、适用于偏远地区,且抗干扰能力强的检测方法十分重要。环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP）是由Notomi等人于2000年报道的一种分子生物学检测新技术。此技术针对靶基因的4—6个特异性区域,分别设计特异性引物,在一种具备链置换活性的dna聚合酶（bstdnapolymerase）的作用下,在恒温条件即可实现对目的基因快速、高效、特异性检测。lamp扩增反应过程中会形成大量的、白色焦磷酸镁（mg2p2o7）沉淀,因此,可通过肉眼或运用实时浊度仪检测沉淀生成量的多少来判断扩增反应进行的程度。若在反应前向反应体系中加入钙黄绿素这种复合荧光素,则可通过肉眼直接观察反应体系颜色是否由黄色变为绿色来判断反应是否发生。实际检测中,待检样本通常是复杂的混合物,多种杂质往往会对检测结果产生干扰,难于直接进行检测。免疫磁珠技术（immunomagneticbeadstechniquces）能将靶标物与杂质分离,从而实现靶标物的富集。免疫磁珠技术是20世纪70年代兴起的一种基于免疫学原理的分离技术。此技术是一种利用具有超顺磁性的磁性微球作为载体对目标物进行捕获、富集的生物学技术。这种具有超顺磁性的微球在经过一系列活化后,并与生物基团或者生物配体有效地结合在一起才可形成免疫磁珠,实现对待检物的特异性分离。本研究将免疫磁珠分离技术（immunomagneticseparation,ims）与环介导恒温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplificationofdna,lamp）相结合,以lamp特异性检测为基础,以磁珠捕获dna或免疫磁珠捕获菌体为条件,分别建立了磁珠捕获dna法结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫菌以及免疫磁珠捕获菌体法结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫菌。分别对两种检测方法的lamp检测体系、磁珠捕获体系、免疫磁珠制备体系进行优化,以及分别对每种方法的灵敏度、特异性、抗干扰能力、实际样本应用等多个方面均进行了全面的评价。本研究基于鼠疫菌3a保守序列,设计lamp引物,并以扩增效率、特异性为标准从设计出的多组引物中筛选出最佳引物。并以筛选出的最佳引物为基础,对lamp反应体系中,bstdna聚合酶加入量、dntps加入量、镁离子浓度等反应条件进行了优化,最终建立了25μl体积的lamp反应体系,具体为:10×thermopolbuffer2.5μl,mgso4（100mm）1.5μl,dntpmix（2.5mm）14μl,fip（100mm）0.4μl,bip（100mm）0.4μl,f3（10mm）0.5μl,b3（10mm）0.5μl,lf（10mm）0.2μl,bstdnapolymerase,largefragment（8,000u/ml）1μl,水3μl,模板1μl。65℃反应60min。并对建立的lamp反应体系在鼠疫菌检测方面的灵敏度、特异性及抗干扰能力等性能进行评价。实验结果显示,建立的lamp反应体系在鼠疫菌检测方面有良好的特异性、抗干扰能力,灵敏度可达100copy/ml。在磁珠捕获dna法结合lamp技术快速检测鼠疫菌研究中,将lamp技术与磁珠捕获dna技术相结合,依据磁珠加入量、dna富集程度对磁珠捕获dna体系进行优化,得到最佳体系。并对该检测方法的灵敏度、特异性及抗干扰能力进行了评价,将该方法与常规pcr检测技术进行对比。实验结果显示,该方法特异性良好,对鼠疫菌检测灵敏度可达10copy/ml,较常规pcr技术灵敏度高100倍。在脾脏、肺脏干扰情况下其灵敏性依然可以达到10copy/ml,比常规pcr技术高出1000倍。在肝脏悬液干扰情况下该检测方法的灵敏度稍有降低至103copy/ml,仍然比常规pcr技术高出10倍。在免疫磁珠捕获菌体法结合lamp技术快速检测鼠疫菌研究中,首先,基于实验室已有的鼠疫菌f1单克隆抗体,采用edc/nhss化学偶联法将鼠疫菌抗体与磁珠相偶联制备免疫磁珠。按实际捕获效率、抗体偶联率、抗体添加量、检测中免疫磁珠用量等进行了优化,并对该检测方法的灵敏度、特异性、抗干扰能力等方面进行了全面评价,并将该方法与常规pcr检测技术进行对比。实验结果显示,该方法可特异地捕获待检混合物中的鼠疫菌,灵敏度为1copy/ml,较常规pcr技术灵敏度高100倍。在脾脏、肺脏干扰情况下其灵敏性为10copy/ml,其灵敏度比常规pcr技术高出1000倍。在肝脏干扰情况下灵敏性为100copy/ml,较常规pcr技术高100倍。随后,采用灭活鼠疫菌为免疫原免疫小鼠,经小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、细胞株克隆、腹水制备、抗体纯化等步骤制备出不同于f1抗体的鼠疫菌单克隆抗体,并将制备出的单抗应用于免疫磁珠捕获菌体法结合环介导恒温扩增技术检测鼠疫菌。实验结果显示,制备出的抗体效价较高,且在检测方法上有较好的灵敏度,可应用于鼠疫菌的快速检测。本研究建立了两种较为成熟的鼠疫菌检测方法,这两种检测方法操作简便、无需大型仪器、成本低廉,且具有较高的灵敏性、极强的特异性、很强的抗干扰能力,所以,这两种检测技术适合用于现场筛查、野外作业及偏远地区检测工作的应用。在现有免疫学检测方法中,表达于鼠疫菌表面的F1抗原已成为唯一的靶标物,而鼠疫菌只有以37℃人工培养或哺乳动物体内为条件才可在表面形成F1抗原,而鼠疫菌最适生长温度为26℃,且自然环境中温度远远低于37℃,因此,自然环境下,鼠疫菌表面并不表达F1抗原。这一现象的存在,对现有鼠疫菌免疫学方法的检测带来诸多不便。本研究制备出的单克隆抗体对表面不表达F1抗原的鼠疫菌有良好的特异性,弥补了现阶段免疫学检测的漏洞,为鼠疫菌的检测提供了更广阔的前景。
魏嘉良[7]（2013）在《蜱传媒病中鼠疫、野兔热病原检测方法的建立及疫病情况调查》文中进行了进一步梳理鼠疫和野兔热均为流行于人类和动物中典型的自然疫源性疾病,呈世界性分布,其病原体分别为鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗郎西斯菌,主要通过蜱等媒介叮咬或宿主间接触等方式传播,而引起人和动物的一直急性、烈性传染病。目前两种病原在自然界中的宿主主要包括哺乳动物和节肢动物,如鼠、兔、牛、羊、蜱等多达数百种。由于两种疫病传播速度快、感染剂量低、致死率高,所以两种病原均被列为A类生物恐怖制剂,并得到了世界广泛关注。我国东北三省及内蒙地区是两种病原的自然疫源地。为了了解该地区的流行病学情况,本研究建立了两种病原的PCR、荧光PCR、LAMP检测方法。利用所建立的方法和已知方法对蜱和血清中的两种病原进行抗原抗体检测研究。根据土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白,设计合成特异性引物,通过优化反应体系,建立PCR检测方法,扩增片段为123bp；采用标准的鼠疫耶尔森氏菌PCR方法（卫标）,扩增片段为249bp。经过敏感性PCR检测,对鼠疫耶尔森菌的最低检出拷贝数为3.02×106copies/μL;对土拉弗朗西斯菌最低检出拷贝数最低为6.4×108copies/μL。针对鼠疫耶尔森氏菌SY-1基因和土拉弗朗西斯菌外膜蛋白基因分别设计特异性引物和探针,建立两种病原的荧光PCR方法。构建两条对应荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森菌和土拉弗朗西斯菌的标准曲线,其相关系数分别为1（SY-1引物）和0.998（TL-fopA引物）,均呈现良好线性。通过特异性敏感性试验,方法特异性高、敏感性好。根据鼠疫耶尔森氏菌3a染色体基因序列设计并合成2对特异性引物,经过条件及体系的优化,建立了LAMP检测方法。通过浊度仪检测该方法可在40min左右判定结果。特异性敏感性实验结果表明,所建立的方法特异性高,敏感性好,可检测最低核酸拷贝数为3.02×104copies/μL。利用本研究所建立的方法对东北三省及内蒙地区捕捉的4797只蜱中的两种病原进行检测；结果显示为土拉弗郎西斯菌平均感染率为1.45%；吉林省总体染病率为2.37%,内蒙古总体染病率为3.37%,黑龙江省、辽宁省均为阴性；鼠疫耶尔森氏菌均无阳性出现。测序结果同源性高。应用北京军事兽医研究所微生物实验室鼠疫耶尔森氏菌IFA间接免疫荧光试剂盒和美国FULLER公司的土拉弗朗西斯菌IFA间接免疫荧光试剂盒对908份血清样品进行抗体检测,共检测出土拉弗朗西斯菌44份阳性血清,864份阴性。平均感染率为4.84%。其中吉林省总体感染率最高为10.71%,其次为内蒙古总体感染率为6.93%,其他两省均为阴性。鼠疫耶尔森氏菌均为阴性。本研究对蜱传媒病中鼠疫、野兔热的流行病学调查,在一定程度上证实了疾病在东北三省及内蒙地区的流行情况与分布情况,得到了蜱中和血清中两种病原的感染率,为该地区进行更详细更深入的调查研究打下了基础。
李禾,吴忠华,郑伟,吕沁风[8]（2011）在《复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究》文中进行了进一步梳理目的建立用复合探针荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法研究根据鼠疫耶尔森氏菌pla基因的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,用于鼠疫的筛选和诊断。结果该检测方法的特异性为100%,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×1011×106拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×102cfu/ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定3次及同一时间5次重复实验结果Cv值均<5%。结论本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,可对鼠疫耶尔森氏菌进行快速检测、准确辨别和早期诊断,对鼠疫的早期快速诊断具有重要意义。
陈晓浪[9]（2010）在《仔猪大肠杆菌病的快速诊断与仔猪腹泻自家灭活疫苗的研制》文中提出仔猪大肠杆菌病仍然是危害我国养猪业的重要疾病,给养猪业带来的损失不可低估,因此研究该病的快速诊断和有效防治方法具有重要意义。断奶仔猪水肿病（postweaning edema disease in piglets）是由产志贺毒素大肠杆菌（shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）感染引起,其初步诊断主要依赖临床检查及死后剖检,确诊则必须进行病原菌分离鉴定。本研究根据发表的志贺毒素2型变异体（shiga-toxin2e, Stx2e）基因序列设计1对引物,建立了检测STEC的PCR方法,经已知毒素类型参考菌株检测证明能够特异鉴定STEC采集疑似仔猪水肿病猪死前直肠棉拭子样品5份和死后十二指肠病料15份,接种LB肉汤,37℃培养4-6h后,用建立的PCR对培养物进行快速检测,结果19份为STEC检测阳性,表明该PCR诊断方法不仅具有简单、快速、可靠等优点,而且适合于病猪死前检测。产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是仔猪腹泻（porcine diarrhea）的主要病原。本研究根据发表的大肠杆菌肠毒素STl、ST2、LT1以及耶尔森氏菌强毒力岛（high pathogenicity island, HPI）基因序列设计引物,建立了基于毒力基因检测ETEC诊断PCR方法。已知毒力型参考菌株的扩增结果表明,建立的PCR方法能特异鉴定ETEC和HPI+大肠杆菌。采集临床腹泻病仔猪肛拭子样品200份,接种LB肉汤,37～℃培养4-6h后进行PCR检测,结果显示105份（52.5%）为HPI+大肠杆菌检测阳性,15份（7.5%）为HPI+大肠杆菌和ETEC检测阳性,13份（6.5%）为ETEC检测阳性,表明该方法具有快速、准确和适合活体检测等优点。为了进一步研究HPI+大肠杆菌与仔猪腹泻的相关性,采集临床腹泻仔猪和健康仔猪肛拭子样品,接种LB肉汤,37℃培养4-6h后用上述PCR进行检测。结果显示：在110份临床腹泻仔猪肛拭子样品中,64份（58.18%）为HPI+大肠杆菌检测阳性；在54份临床健康仔猪样品中,仅24份（44.44%）为HPI+大肠杆菌检测阳性。从64份HPI+大肠杆菌检测阳性腹泻仔猪肛拭子样品中分离得600株大肠杆菌,25株经PCR鉴定为HPI+大肠杆菌,其中2株（8%）为F4+,4株（16%）为F6+,2株（8%）为F4+和F6+,1株（4%）为F6+LT1+ST2+。从24份HPI+大肠杆菌检测阳性临床健康仔猪肛拭子样品中分离得480株大肠杆菌,经PCR鉴定20株为HPI+大肠杆菌,其中仅1株（5%）为LT1+ST2+,未发现携带菌毛的大肠杆菌。血清学检测结果表明,0138为HPI+大肠杆菌的优势抗原型。结合先前的研究资料可以推测,HPI+大肠杆菌为仔猪腹泻的条件性致病菌。为了研制更有针对性的疫苗用于防疫,本研究从江苏某种猪场采集腹泻仔猪肛拭样品40份,经短暂液体培养后进行的PCR检测显示,62.5%的检测样品为HPI+大肠杆菌检测阳性,12.5%为HPI+大肠杆菌和ETEC检测阳性,5%为ETEC检测阳性。从中选择2个优势菌株制备双价氢氧化铝胶灭活自家疫苗,同场母猪免疫接种试验结果表明,其所产的46头仔猪的腹泻发病率为23.9%,商品化大肠杆菌三价灭活苗免疫母猪所产仔猪的腹泻发生率为28.9%,而非免疫组的仔猪腹泻发生率为55.5%。黏附抑制试验结果表明,免疫组和对照组母猪分娩后第一天的乳清抗体均能抑制K88+和987P+与猪小肠上皮细胞的黏附,第7天的乳清抗体均不能抑制K88+大肠杆菌与小肠上皮细胞的黏附,而免疫组母猪分娩后第7天的乳清抗体能明显抑制987P+大肠杆菌与猪小肠上皮细胞的黏附。
李艳君[10]（2009）在《鼠疫耶尔森氏菌基因组多态性研究及快速鉴定溯源系统的建立》文中认为鼠疫是一种流行在啮齿动物间通过跳蚤传播的自然疫源性疾病,鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis,以下简称鼠疫菌）是鼠疫的病原菌,在历史上曾经引发三次世界范围的鼠疫大流行,给人类带来巨大的灾难。近年来,鼠疫在亚非地区的流行有增无减,动物间疫情呈活跃态势,鼠疫的防治仍是不容忽视的问题。另外,鼠疫菌也是生物武器缔约国专家组所确定的标准生物战剂,非常有可能应用于生物战和生物恐怖袭击,因此对鼠疫菌进行基因组多态性研究,建立多态性数据库,对疫情爆发和生物恐怖袭击发生时鼠疫菌的快速鉴定溯源具有非常重要的意义。鼠疫菌在进化过程中基因组不断发生变异以适应新的生态位,逐渐形成具有不同特点的鼠疫菌菌株。细菌基因组变异的主要分子策略包括点突变,基因的获得和缺失、基因重排和重复序列拷贝数变化,本研究针对各种基因组变异形式设计了不同的分子生物学实验方法,系统地考察了鼠疫菌基因组多态性,筛选出精简有效的的分子靶标,建立了中国鼠疫菌快速鉴定溯源系统。同时,通过大量数据分析,深入探讨了鼠疫菌的适应性进化以及与之密切相关的鼠疫自然疫源地形成与扩张过程。基于SNPs分析的鼠疫菌遗传关系框架的构建单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）是一种稳定的遗传标记,能够用来推测物种进化方向和进化年代,已经广泛应用于生物遗传关系的研究。本研究在Achtman等人研究的基础上,选择45个SNPs位点,对121株涵盖4个生物型,分离自不同疫源地和宿主的代表性菌株进行了分析,将其分成12个SNPs型,建立了基于45个SNPs的鼠疫菌遗传关系框架,将鼠疫菌分成3个进化分支,与假结核耶尔森氏菌相比,Branch 0中SNPs突变最少,认为是一个比较古老的分支,其中包括了0.PE4型的田鼠型菌株和较为古老的0.PE5和0.PE6型的古典型菌株;Branch 1分支中包括了1.ORI的东方型菌株和与之关系密切的1.ANT的古典型菌株;Branch 2分支中包括了2.MED的中世纪型菌株和与之关系密切的2.ANT的古典型菌株。该遗传关系框架的建立为使用其他遗传标记对鼠疫菌进行多态性研究提供了遗传关系上的参考。基于基因获得和缺失的鼠疫菌基因分型系统的完善在本实验室前期研究中,通过芯片比较基因组学分析和抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）在鼠疫菌基因组中鉴定出23个差异区段（Different region,DFR）,并对大量菌株进行了分析。本研究对前期获得的数据进行补充验证,对最终909株鼠疫菌的DFR数据进行全面系统的分析,完善了基于DFR中国鼠疫菌基因分型体系,将909株中国鼠疫菌代表株分成32个基因组型,同时提出了主要基因组型和次要基因组型的概念,主要基因组型呈明显的疫源地特异性,但是鉴于DFR分型方法分辨率低的局限性,仍存在不同疫源地的菌株具有同一基因组型的情况。通过与完成测序的鼠疫菌及假结核菌DFR谱的比较,我们得以在一定程度上探讨了中国与国外鼠疫菌的差异,得出一系列有意义的推论:基于减数进化的理论,本研究的结果显示中国的东方型菌株较国外的东方型菌株古老,支持了东方型菌株起源于中国的推论;新疆鼠疫菌的DFR谱呈现出高度的多态性,说明新疆是中国与中亚鼠疫菌频繁交换传播的通道。DFR分型方法操作简便,成本低廉,适用于大量菌株的快速分型,随着尽可能多的新DFR的鉴定,DFR分型方法会日臻完善。基于串联重复序列的鼠疫菌基因组多态性研究鼠疫菌是一类比较年轻的菌种,进化时间短,基因组中还没有积累足够多的变异,因此需要一种多态性高的遗传标记来区分近缘菌株。本研究采用高分辨率的MLVA（multi- locus VNTR analysis,多位点串联重复序列分析）方法,对鼠疫菌基因组中可变数目串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeat,VNTR）进行深入系统的研究。目前在鼠疫菌MLVA研究领域中有两套较为常用的位点,一套是法国第十一大学的Vergnaud博士实验室鉴定的25个位点,另一套是美国Arizona大学Keim博士实验室鉴定的42个位点。我们首先选择Vergnaud等人鉴定的适合琼脂糖凝胶电泳分析的25个位点,对383株中国代表性鼠疫进行分析,通过与法国和俄罗斯实验室的数据交流,将共计近500株来自中国、前苏联、蒙古及部分欧洲地区的鼠疫菌分成350个基因型。这25个位点分辨率高,能很好地区分DFR方法不能分开的来自L和M疫源地、G和H疫源地及I和K1疫源地菌株。综合国外数据,我们首次深入探讨了中国与国外菌株的关系,推测了鼠疫菌传播及自然疫源地扩张模式。由于方法学的局限性,25个VNTR位点的平均重复基序大小为17bp,不能够代表广泛分布于基因组中VNTR。在进一步的研究中,我们选择了94株具备SNP分析数据的代表性菌株对基于上述两套位点的分型聚类关系进行分析,发现与SNPs遗传关系框架相比,两套位点都存在一定的局限性。产生这种现象的原因可能是国外鼠疫菌菌型较单一,导致对VNTR位点选择有所偏差。本研究利用中国鼠疫菌资源丰富的优势对鼠疫菌基因组中的VNTR位点进行了系统的筛选,最终获得了18个多态性高,与SNPs框架相比能够较好反映鼠疫菌各组群聚类关系的位点,为鼠疫菌的快速鉴定溯源提供精简有效的分子靶标,同时研究中获取的近10万个基因组多态性数据大大丰富了本室前期建立的鼠疫菌基因组多态性数据库,为鼠疫菌的鉴定溯源提供了宝贵资料。基于插入序列的鼠疫菌基因分型方法的探索插入序列（Insertion Sequence, IS）是一种可移动的DNA元件,在转座酶的作用下可以从基因组中的一个位点转移到另一个位点,促进了基因组的重排、改变了基因的表达,是细菌基因组变异的主要动力之一。本研究对以前基于PCR的IS研究方法进行探讨,发现由于鼠疫菌基因组中插入序列重排情况非常复杂,仅仅依据PCR扩增结果阴性或阳性判定IS的插入状态会给分型结果造成偏差,影响系统发育关系的正确构建。本研究为今后IS在鼠疫菌基因组中的多态性研究积累了宝贵经验。中国鼠疫菌快速鉴定溯源系统的建立对本研究中所获得的大量数据进行综合分析,发现几种遗传标记在鼠疫菌基因组多态性研究中所起的作用各有千秋。SNPs作为一种稳定的遗传标记,能够准确地反映出鼠疫菌各组群之间的遗传关系,确定进化方向和进化时间,适合用于鼠疫菌的微进化研究,但分辨率差,成本较高,不利于作为一种常规检测手段普及应用。IS的研究仅依靠简单的PCR判断插入序列的有无大大降低了分辨率,难以获得准确可靠的结果。基于DFR的分型方法操作简便,重现性好,成本低廉,易于普及,但由于该方法分辨率不高,无法对所有鼠疫菌株进行准确的区分和溯源。多位点VNTR分析分辨率高,合理选择位点能正确反映菌株间的聚类关系,但操作较为繁琐耗时。综合DFR和MLVA方法的特点,本研究选用5个DFR位点和8个VNTR位点,建立了中国鼠疫菌快速鉴定溯源系统。借助鼠疫菌基因组多态性数据库及相关分析软件,可以将菌株定位到不同的地理位置。为将来疫情爆发或生物恐怖袭击发生时鼠疫菌的快速鉴定溯源提供了有力工具。
二、PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌（论文提纲范文）
（1）新疆古代致病菌基因组学与进化历史研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 古微生物学概念和研究对象 |
| 1.1.1 古微生物学概念 |
| 1.1.2 古微生物学的研究对象 |
| 1.2 古微生物学研究内容和进展 |
| 1.2.1 细菌性传染病 |
| 1.2.2 螺旋体传染病 |
| 1.2.3 病毒性传染病 |
| 1.3 古微生物学的研究方法 |
| 1.3.1 形态学观测 |
| 1.3.2 DNA检测 |
| 1.4 古微生物学现状 |
| 1.5 立题依据 |
| 第二章 新疆古代人群致病菌的筛查 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.2 实验样本 |
| 2.2.1 遗址背景 |
| 2.2.2 研究材料 |
| 2.3 试剂耗材与实验方法 |
| 2.3.1 试剂耗材 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.4 数据分析方法 |
| 2.4.1 原始数据的处理 |
| 2.4.2 宏基因组筛查 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 宏基因组工具的比较 |
| 2.5.2 对古代样本的筛查结果 |
| 2.5.3 古代沙门氏菌的真实性判断 |
| 2.6 本章小结和讨论 |
| 第三章 古代沙门氏菌基因组的构建 |
| 3.1 背景介绍 |
| 3.1.1 液相捕获的原理 |
| 3.1.2 沙门氏菌基因组 |
| 3.2 实验样本 |
| 3.2.1 样本背景 |
| 3.2.2 研究材料 |
| 3.3 试剂耗材与实验方法 |
| 3.3.1 试剂耗材 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.4 数据分析方法 |
| 3.4.1 原始数据的简单处理 |
| 3.4.2 基因组的构建 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 捕获效率的评估 |
| 3.5.2 古代沙门氏菌基因组的构建 |
| 3.6 本章小结和讨论 |
| 第四章 古代沙门氏菌的进化和宿主选择 |
| 4.1 背景介绍 |
| 4.1.1 沙门氏菌的分类 |
| 4.1.2 沙门氏菌致病岛 |
| 4.1.3 假基因 |
| 4.2 数据分析方法 |
| 4.2.1 SNP获取、评估和系统发育分析 |
| 4.2.2 毒力因子分析 |
| 4.2.3 进化时间分析 |
| 4.2.4 假基因分析 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 古代沙门氏菌菌株的系统发育关系 |
| 4.3.2 古代沙门氏菌与现代菌株的毒力比较 |
| 4.3.3 沙门氏菌各支系分时间节点的估算 |
| 4.3.4 古代沙门氏菌的宿主推测 |
| 4.4 本章小结和讨论 |
| 第五章 古代沙门氏菌的传播和人群迁移的关联 |
| 5.1 背景介绍 |
| 5.1.1 古代人类基因组的研究对象 |
| 5.1.2 中国古代人类基因组研究现状 |
| 5.2 数据分析方法 |
| 5.2.1 原始数据处理 |
| 5.2.2 群体遗传学分析 |
| 5.3 研究结果 |
| 5.3.1 真实性评估 |
| 5.3.2 单亲遗传标记信息 |
| 5.3.3 全基因组信息 |
| 5.3.4 主成分分析 |
| 5.3.5 F3检验 |
| 5.3.6 F4检验 |
| 5.3.7 Admixture分析 |
| 5.3.8 qpAdm检验 |
| 5.4 本章小结和讨论 |
| 5.4.1 本章小结 |
| 5.4.2 古代沙门氏菌传播的讨论 |
| 第六章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1. 沙门氏菌ParaC支系古代样本的私有SNP |
| 附录2. 泉儿沟人群与欧亚大陆现代人群的f3-statistics分析 |
| 附录3. 泉儿沟人群与欧亚大陆古代人群的f3-statistics分析 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 斑点叉尾鮰养殖概况 |
| 2 鮰爱德华氏菌研究进展 |
| 2.1 生物学特性 |
| 2.2 宿主种类和范围 |
| 2.3 相关毒力因子研究 |
| 2.5 鮰爱德华氏菌外膜蛋白的研究 |
| 2.6 鮰爱德华氏菌的疫苗研究 |
| 3 鲁氏耶尔森氏菌研究进展 |
| 3.1 生物学特性 |
| 3.2 宿主种类和范围 |
| 3.3 相关毒力因子研究 |
| 3.4 鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白研究 |
| 3.5 鲁氏耶尔森氏菌疫苗研究 |
| 4 渔用疫苗研究进展 |
| 4.1 渔用疫苗的发展历程 |
| 4.2 渔用疫苗的种类 |
| 4.3 渔用疫苗的免疫方式 |
| 5 渔用口服疫苗载体研究 |
| 5.1 微囊和微球载体 |
| 5.2 减毒细菌载体 |
| 5.3 生物被膜载体 |
| 5.4 生物载体疫苗 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 鮰爱德华氏菌OmpN2 与鲁氏耶尔森氏菌OmpF基因的分子克隆与生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增 |
| 2.3 重组克隆质粒的构建 |
| 2.4 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.5 核苷酸序列特征分析 |
| 2.6 氨基酸序列特征分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增和T克隆鉴定 |
| 3.2 核苷酸序列特征分析 |
| 3.3 氨基酸序列特征分析 |
| 3.4 OmpN2和OmpF核苷酸和氨基酸序列相似性比对 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 OmpN2与OmpF的原核表达与免疫原性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增 |
| 2.3 重组克隆质粒的构建 |
| 2.4 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.5 重组表达质粒的构建 |
| 2.6 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.7 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.8 重组蛋白的大量制备及纯化 |
| 2.9 兔抗重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.10 Western blotting分析 |
| 2.11 目的蛋白在细菌表面分布验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF的表达及纯化 |
| 3.3 重组蛋白的免疫原性分析 |
| 3.4 目的蛋白在细菌表面的分布 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 二联融合基因N2-F的构建,分子克隆,原核表达与免疫原性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 Linker序列选择与引物设计 |
| 2.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linker-F的构建与鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒P-N2-linker-F的构建与鉴定 |
| 2.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化 |
| 2.6 兔抗融合蛋白N2-F多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.7 融合蛋白N2-F免疫原性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 N2-linker与 linker-F的 PCR扩增 |
| 3.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linlker-F的构建与鉴定 |
| 3.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定 |
| 3.4 重组表达质粒P-N2-Linker-F的构建与鉴定 |
| 3.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化 |
| 3.6 融合蛋白N2-F的免疫原性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 二联基因N2-F亚单位疫苗对斑点叉尾鮰免疫效果分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 疫苗、菌株与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细菌复壮 |
| 2.2 亚单位疫苗制备 |
| 2.3 免疫程序 |
| 2.4 收集血清 |
| 2.5 血清免疫相关指标检测 |
| 2.6 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 2.7 免疫相关基因表达分析 |
| 2.8 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清抗体水平检测 |
| 3.2 血清溶菌酶活性检测 |
| 3.3 血清补体C3 活性检测 |
| 3.4 血清总蛋白含量检测 |
| 3.5 血清SOD活性检测 |
| 3.6 免疫相关基因表达分析 |
| 3.7 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 二联基因口服微球疫苗的制备、条件优化及理化特性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 蛋白与主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 海藻酸钠-壳聚糖复合微球制备流程 |
| 2.2 包封率和载药率测定 |
| 2.3 单因素试验 |
| 2.4 响应面试验 |
| 2.5 口服微球疫苗的理化特性分析 |
| 2.6 口服微球疫苗的抗原性检测 |
| 2.7 口服微球疫苗的安全性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 单因素试验 |
| 3.2 响应面试验结果 |
| 3.3 响应面分析及结果验证 |
| 3.4 口服微球疫苗的理化特性分析 |
| 3.5 口服微球疫苗的抗原性检测 |
| 3.6 口服微球疫苗的安全性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第七章 二联基因口服疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 疫苗、菌株与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 口服微球疫苗制备 |
| 2.2 口服疫苗饲料制备 |
| 2.3 免疫程序 |
| 2.4 血清和肠粘液采集 |
| 2.5 肠黏液免疫相关指标检测 |
| 2.6 血清免疫相关指标检测 |
| 2.7 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 2.8 免疫相关基因表达分析 |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肠黏液免疫指标 |
| 3.2 血清免疫相关指标 |
| 3.3 免疫相关基因表达分析 |
| 3.4 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）LAMP和RealAmp技术检测四种细菌性生物战剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要中英文缩写索引 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 土拉弗朗西斯氏菌研究现状 |
| 1.1.1 土拉弗朗西斯氏菌病原学 |
| 1.1.2 土拉热流行概况及其危害 |
| 1.1.3 土拉弗朗西斯氏菌鉴定技术进展 |
| 1.2 类鼻疽伯克霍尔德菌研究现状 |
| 1.2.1 类鼻疽伯克霍尔德菌病原学 |
| 1.2.2 类鼻疽病流行概况及其危害 |
| 1.2.3 类鼻疽伯克霍尔德菌鉴定技术进展 |
| 1.3 布鲁氏菌研究现状 |
| 1.3.1 布鲁氏菌病原学 |
| 1.3.2 布鲁氏菌流行概况及其危害 |
| 1.3.3 布鲁氏菌鉴定技术进展 |
| 1.4 鼠疫耶尔森氏菌研究现状 |
| 1.4.1 鼠疫耶尔森氏菌病原学 |
| 1.4.2 鼠疫耶尔森氏菌流行概况及其危害 |
| 1.4.3 鼠疫耶尔森氏菌鉴定技术进展 |
| 1.5 环介导等温扩增技术 |
| 1.6 实时荧光环介导等温扩增技术 |
| 1.7 本课题的主要研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 LAMP引物设计 |
| 2.2.2 LAMP和 RealAmp反应条件和体系 |
| 2.2.3 质粒的制备 |
| 2.2.4 特异性实验 |
| 2.2.5 灵敏度实验 |
| 2.2.6 土壤模拟样本检测 |
| 2.2.7 PCR、LAMP、Real Amp 和荧光定量 PCR 的对比分析 |
| 第3章 结果 |
| 第一部分 LAMP 检测四种细菌性生物战剂的应用研究 |
| 3.1 环介导等温扩增产物的电泳结果 |
| 3.2 优化环介导等温扩增反应体系 |
| 3.2.1 体系温度的单因素优化 |
| 3.2.2 体系引物对比例的单因素优化 |
| 3.2.3 体系dNTPs的单因素优化 |
| 3.2.4 体系Mg~(2+)浓度的单因素优化 |
| 3.2.5 体系Betaine浓度的单因素优化 |
| 3.3 LAMP特异性实验 |
| 3.3.1 土拉弗朗西斯氏菌特异性实验结果 |
| 3.3.2 类鼻疽菌特异性实验结果 |
| 3.3.3 布鲁氏菌特异性实验结果 |
| 3.3.4 鼠疫菌特异性实验结果 |
| 3.3.5 LAMP特异性验证 |
| 3.4 LAMP灵敏度实验 |
| 3.4.1 以重组质粒为模板的灵敏度实验 |
| 3.4.2 以基因组DNA为模板的灵敏度实验 |
| 3.5 土壤模拟样本检出限的LAMP检测 |
| 第二部分 Real Amp 检测四种细菌性生物战剂的应用研究 |
| 3.6 RealAmp扩增产物的结果 |
| 3.7 RealAmp特异性实验 |
| 3.7.1 土拉弗朗西斯氏菌特异性实验结果 |
| 3.7.2 类鼻疽菌特异性实验结果 |
| 3.7.3 布鲁氏菌特异性实验结果 |
| 3.7.4 鼠疫菌特异性实验结果 |
| 3.7.5 特异性验证 |
| 3.8 RealAmp灵敏度 |
| 3.8.1 以重组质粒为模板的灵敏度实验 |
| 3.8.2 以基因组DNA为模板的灵敏度实验 |
| 3.9 土壤模拟样本检出限的RealAmp检测 |
| 3.10 PCR、LAMP、RealAmp和 qPCR的对比分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）鼠伤寒沙门氏菌致病机制的研究（论文提纲范文）
| 第一部分 巨噬细胞释放的鼠伤寒沙门氏菌通过与CD209相互作用促进其在宿主体内的感染和播散 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 鼠伤寒沙门氏菌的PgtE利用CD205促进鼠疫菌感染的研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 沙门氏菌外膜蛋白PgtE的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录1攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 鼠疫流行现状 |
| 1.2 小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌流行现状 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 三种致病耶尔森菌PCR检测结果 |
| 3.2 三种致病耶尔森菌筛查基因确定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1：测序结果 |
| 附录2：研究生期间发表论文 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）免疫磁珠捕获技术结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森氏菌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 1 鼠疫菌的研究进展 |
| 1.1 鼠疫的流行及危害 |
| 1.2 鼠疫菌的生物学特性及致病机制 |
| 1.3 鼠疫菌常规检测技术现状 |
| 1.3.1 细菌学检测 |
| 1.3.2 免疫学检测 |
| 1.3.3 分子生物学检测 |
| 2 环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA, LAMP） |
| 2.1 环介导恒温扩增技术的原理 |
| 2.2 环介导恒温扩增技术的应用 |
| 3 免疫磁珠技术（ immunomagnetic beads techniquces） |
| 3.1 免疫磁珠技术的原理 |
| 3.2 免疫磁珠技术的应用 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 5 本研究的内容 |
| 第一章 鼠疫菌LAMP最佳引物的筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器和试剂 |
| 2.1.2 实验菌株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 LAMP引物设计与合成 |
| 2.2.2 DNA模板的制备 |
| 2.2.3 LAMP反应体系及扩增条件 |
| 2.2.4 LAMP扩增反应检测 |
| 2.2.5 特异性试验 |
| 2.2.6 灵敏度实验 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 最佳引物筛选 |
| 3.2 最佳环引物筛选 |
| 3.3 特异性实验 |
| 3.4 LAMP检测鼠疫菌的灵敏度 |
| 4 结论 |
| 第二章 环介导恒温扩增体系的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器和试剂 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DNA模板的制备 |
| 2.2.2 LAMP反应体系及扩增条件 |
| 2.2.3 常规PCR反应体系及扩增条件 |
| 2.2.4 LAMP自建体系中Mg2+加入量优化 |
| 2.2.5 LAMP自建体系中dNTPs加入量优化 |
| 2.2.6 LAMP自建体系中Bst DNA聚合酶加入量优化 |
| 2.2.7 LAMP扩增鼠疫菌灵敏度检测 |
| 2.2.8 LAMP扩增鼠疫菌特异性检测 |
| 2.2.9 LAMP扩增11株耶尔森氏菌混合菌液检测 |
| 2.2.10 小鼠脏器干扰实验 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 LAMP自建体系中Mg2+加入量优化 |
| 3.2 LAMP自建体系中dNTPs加入量优化 |
| 3.3 LAMP自建体系中Bst DNA聚合酶加入量优化 |
| 3.4 LAMP扩增鼠疫菌灵敏度检测 |
| 3.5 LAMP扩增鼠疫菌特异性检测 |
| 3.6 LAMP扩增11株耶尔森氏菌混合菌液检测 |
| 3.7 小鼠脏器干扰实验 |
| 4 结论 |
| 第三章 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术的建立并用于检测鼠疫耶尔森氏菌 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂和仪器 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DNA模板的制备 |
| 2.2.2 LAMP反应体系及扩增条件 |
| 2.2.3 常规PCR反应体系及扩增条件 |
| 2.2.4 磁珠捕获DNA |
| 2.2.5 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术检测混合菌液中DNA |
| 2.2.6 磁珠捕获DNA体系优化 |
| 2.2.7 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术用于小鼠脏器干扰实验 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术检测混合菌液中DNA |
| 3.2 磁珠捕获DNA体系优化 |
| 3.3 磁珠捕获DNA法结合环介导恒温扩增技术用于小鼠脏器干扰实验 |
| 4 结论 |
| 第四章 免疫磁珠捕获菌体法结合环介导恒温扩增技术的建立并用于检测鼠疫耶尔森氏菌 |
| 第一部分 基于鼠疫菌F1抗体制备免疫磁珠结合环介导恒温扩增技术的建立及应用 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂与仪器 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 合成 |
| 2.2.2 免疫磁珠制备及菌体的捕获 |
| 2.2.3 LAMP反应体系及扩增条件 |
| 2.2.4 应体系及扩增条件 |
| 2.2.5 免疫磁珠捕获鼠疫菌灵敏度检测 |
| 2.2.6 免疫磁珠捕获鼠疫菌特异性检测 |
| 2.2.7 免疫磁珠偶联抗体量优化 |
| 2.2.8 捕获菌体所用免疫磁珠量优化 |
| 2.2.9 脏器掺菌实验 |
| 2.2.10 实际样本检测 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 免疫磁珠捕获鼠疫菌灵敏度检测 |
| 3.2 免疫磁珠捕获鼠疫菌特异性检测 |
| 3.3 免疫磁珠偶联抗体量优化 |
| 3.4 捕获菌体所用免疫磁珠量优化 |
| 3.5 脏器掺菌实验 |
| 3.6 实际样本检测 |
| 4 结论 |
| 第二部分 鼠疫菌（26℃培养）单克隆抗体的制备及应用 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器与试剂 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫原的制备 |
| 2.2.2 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 抗体浓度及效价的测定 |
| 2.2.4 抗体鉴定 |
| 2.2.5 免疫磁珠结合LAMP技术检测鼠疫菌（26℃培养）体系的建立及评价 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1 单克隆抗体浓度和效价 |
| 3.2 单克隆抗体分型鉴定 |
| 3.3 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.4 免疫磁珠捕获鼠疫菌灵敏度检测 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 主要仪器 |
| 常用试剂及配制方法 |
| 个人简历 |
| 主要学习经历 |
| 攻读硕士研究生期间获得的奖励 |
| 在学期间的研究成果目录 |
| 承担课题 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
（7）蜱传媒病中鼠疫、野兔热病原检测方法的建立及疫病情况调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鼠疫国内外流行情况与检测技术的研究进展 |
| 1.1 国内外流行情况 |
| 1.2 检测方法 |
| 1.3 展望 |
| 第二章 野兔热国内外流行情况与检测技术的研究进展 |
| 2.1 国内外流行病学 |
| 2.2 检测方法 |
| 2.3 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 鼠疫耶尔森氏菌PCR检测方法的验证和土拉弗朗西斯菌PCR检测方法的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗朗西斯菌Taq-man荧光PCR检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鼠疫耶尔森氏菌LAMP检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 东北三省及内蒙地区蜱传鼠疫、野兔热流行病学调查 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂和菌种 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 核酸提取方法 |
| 1.2.2 PCR反应体系 |
| 1.2.3 PCR的特异性测定 |
| 1.2.4 PCR的敏感性测定 |
| 1.2.5 PCR的重复性测定 |
| 1.2.6 标准曲线制备 |
| 1.2.7 模拟标本的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 特异性 |
| 2.2 敏感性 |
| 2.3 重复性检测结果从表5可知, 强阳性质控品、 |
| 2.4 标准曲线 |
| 2.5 模拟标本检测 |
| 3 讨论 |
（9）仔猪大肠杆菌病的快速诊断与仔猪腹泻自家灭活疫苗的研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 大肠杆菌与仔猪疾病 |
| 1.1 大肠杆菌的一般特性与分类 |
| 1.2 大肠杆菌引起的仔猪疾病 |
| 1.3 仔猪大肠杆菌病的预防 |
| 2 大肠杆菌常见的毒力因子 |
| 2.1 肠毒素(enterotoxin) |
| 2.2 志贺氏菌毒素(Shiga toxin,Stx) |
| 2.3 黏附素性菌毛(adhesive fimbriae) |
| 2.4 毒力岛(pathogenicity island,PAI) |
| 参考文献 |
| 研究一：致仔猪水肿病大肠杆菌的PCR快速诊断 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二：致仔猪腹泻大肠杆菌的PCR快速检测 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三：HPI~+大肠杆菌与仔猪腹泻的相关性研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究四：大肠杆菌性仔猪腹泻自家疫苗的研制及应用 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究五：免疫母猪初乳对大肠杆菌黏附猪肠上皮细胞的阻断作用 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）鼠疫耶尔森氏菌基因组多态性研究及快速鉴定溯源系统的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一章 基于 SNPs 分析的鼠疫菌遗传关系框架的构建 |
| 1. 导论 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二章 基于差异区段的鼠疫菌基因分型系统的完善 |
| 1. 导论 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三章 基于串联重复序列的鼠疫菌基因组多态性研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 基于25 个VNTR 位点的鼠疫菌基因组多态性的研究 |
| 1. 导论 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三节 鼠疫菌全基因组 VNTR 位点筛选研究 |
| 1. 导论 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 第四章 基于插入序列的鼠疫菌基因分型方法的探索 |
| 1. 导论 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 第五章 中国鼠疫耶尔森氏菌快速鉴定溯源系统的建立 |
| 1. 导论 |
| 2. 鉴定溯源系统建立的基础 |
| 3. 鉴定溯源系统分子靶标的选择 |
| 4. 鉴定溯源系统使用方法及溯源流程 |
| 5. 小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌（论文参考文献）
- [1]新疆古代致病菌基因组学与进化历史研究[D]. 武喜艳. 吉林大学, 2020(08)
- [2]斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究[D]. 王二龙. 四川农业大学, 2019(07)
- [3]LAMP和RealAmp技术检测四种细菌性生物战剂的研究[D]. 李子微. 南华大学, 2019
- [4]鼠伤寒沙门氏菌致病机制的研究[D]. 叶成林. 华中科技大学, 2019(01)
- [5]云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义[D]. 张艳. 大理大学, 2018(12)
- [6]免疫磁珠捕获技术结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森氏菌的研究[D]. 冯娜. 安徽医科大学, 2017(02)
- [7]蜱传媒病中鼠疫、野兔热病原检测方法的建立及疫病情况调查[D]. 魏嘉良. 吉林农业大学, 2013(S2)
- [8]复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究[J]. 李禾,吴忠华,郑伟,吕沁风. 中国国境卫生检疫杂志, 2011(06)
- [9]仔猪大肠杆菌病的快速诊断与仔猪腹泻自家灭活疫苗的研制[D]. 陈晓浪. 扬州大学, 2010(04)
- [10]鼠疫耶尔森氏菌基因组多态性研究及快速鉴定溯源系统的建立[D]. 李艳君. 中国人民解放军军事医学科学院, 2009(09)