一、基因工程技术提高药用植物次生物质产量研究进展（论文文献综述）
范丽娟[1]（2020）在《黄耆苯丙氨酸解氨酶基因（AmPAL）参与植物抗逆性的功能解析》文中进行了进一步梳理在干旱、盐碱地区园林绿化植物仍比较缺乏,抗逆植物基因工程育种是丰富多逆境环境条件下绿化植物的有效快捷途径之一,其中抗多种非生物胁迫的功能基因的筛选尤为重要。黄耆（Astragalus membranaceus）是抗逆性较强的观赏和药用植物资源,在寒冷、干旱和盐碱地区具有广泛的开发应用前景,也是非常好的抗逆基因资源植物。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）在绿色植物中广泛存在,作为苯丙烷次生代谢和初级代谢的桥梁,通常对植物的生理代谢和逆境胁迫应答有重要作用。本研究对克隆到的黄耆AmPAL基因进行了多逆境条件下的表达特性分析、亚细胞定位及转AmPAL烟草后代表达稳定性检验、对烟草形态发育的影响;并进行了多种非生物胁迫下的抗逆功能解析;通过对同源性较高的烟草NtPAL1蛋白互作网络构建进一步探讨了转AmPAL烟草的抗逆机理;同时开展了AmPAL基因在观赏花卉百合和矮牵牛中的异源转化,以期提高花卉的抗逆性。本研究成果可为今后开展花卉抗逆基因工程育种提供基因资源,也为黄耆抗逆机理深入研究及开发利用奠定了理论研究基础。主要研究结果如下:1.通过RT-PCR技术获得黄耆的PAL基因（AmPAL,EF567076）的全长cDNA序列,该基因具有 Lyasearomatic 结构域,属于 phenylalanine ammol/Lonia-lyase 家族。NJ 法系统进化树分析发现黄耆的PAL与同科的大豆（Glycine max）、豌豆（Pisum sativum）和苜蓿（Medicago sati）聚到一起,相似度分别为89.18%、87.59%和57.36%。2.黄耆AmPAL是响应盐、碱、干旱胁迫的功能基因并响应ABA信号诱导,主要在根中响应胁迫并高表达。在根和叶中AmPAL显着地受盐（NaCl）、碱（NaHCO3）、PEG6000和ABA胁迫诱导表达而显着增加。尤其在根中,NaCl胁迫对AmPAL基因的诱导表达6h后增加了 9.5931倍;NaHCO3胁迫48h后根AmPAL基因表达量增加了24.5243倍。在叶中PEG6000胁迫对AmPAL基因的诱导表达显着,48h胁迫表达持续增加,根中是先增加后减少的表达水平变化,且都高于对照;ABA信号诱导24h时在叶中表达出现高峰,根中的诱导表达量也是增加的趋势。3.构建表达载体pBI121-AmPAL-GFP,应用基因枪法将其转入洋葱表皮细胞中,检测AmPAL-GFP融合蛋白的绿色荧光,表明AmPAL亚细胞定位于细胞膜上。4.构建植物表达载体pCXSN-AmPAL,并遗传转化烟草,经Southern杂交、Northern杂交检测到35S驱动AmPAL在T3代烟草中以单拷贝形式超表达。5.AmPAL基因在逆境胁迫下产生了生理上的系列抗性响应,通过减轻逆境胁迫下膜脂氧化损伤及提高光合效率增强植物抗性,来增强植物抗性,表现出抗性生长。对转AmPAL基因烟草T3代株系抗逆胁迫相关性研究表明:转AmPAL基因烟草2叶龄幼苗在NaCl胁迫下叶片和根生长都受到抑制,但根长生长量、鲜重、PAL酶活性优于野生型（WT）;转基因株系Na+/K+显着高于WT的,提高了 K+的利用率,表现出胁迫下的生长优势。在引起栽培基质pH值变化的NaHCO3胁迫下,转AmPAL基因烟草根比WT的有较好的生长势,而MDA较低;转基因烟草5叶龄幼苗在盐碱、干旱处理下,随着处理浓度增加烟草植株生长均受到抑制,但是过表达AmPAL烟草表现出生长优势。同一浓度处理下,检测到过表达AmPAL烟草幼苗的SOD活性、脯氨酸含量、叶绿素含量及叶绿素荧光参数优于WT。6.AmPAL可能通过某种途径参与了植物的生长发育。通过对过表达AmPAL T3代烟草的生长发育进行观测发现植株变矮、节间距缩短、地径变大、叶片变宽、叶长/叶宽的比例变小等特点,始花期推迟52天,花朵数量有所增加,连续花期延长4天。7.通过NCBI BLAST比对发现AmPAL与烟草NtPAL1同源性最高。NtPAL1基因启动子序列含有大量逆境相关的响应元件及光响应元件,在逆境条件下,这些逆境响应元件会启动NtPAL1基因的表达;NtPAL1蛋白互作网络分析发现10个互作蛋白,其中XP009622435.1、XP009612485.1、XP009631403.1、XP009631897.1、XP009609722.1和XP009607087.1 参与苯丙氨酸代谢途径,XP009612485.1 和XP009631403.1 参与甜菜碱的生物合成,XP009622435.1、XP009631897.1、XP009612485.1和XP009631403.1是维生素B6的基本类型和表现形式,这些产物都与植物抗逆性有关,而转AmPAL基因烟草PAL过表达,进一步促进了这些物质的合成,进而提高了植物的抗逆性。进一步说明AmPAL是提高植物抗逆功能的关键基因。8.构建的pCXSN-AmPAL植物表达载体,通过农杆菌介导法将AmPAL基因分别转入观赏花卉矮牵牛和细叶百合内,通过抗性筛选和抗性植株PCR检测,证明目的基因已成功插入到了矮牵牛和细叶百合的基因组。荧光定量PCR检测到目的基因AmPAL在转基因细叶百合中的过表达。综上,AmPAL基因具有抗逆功能;在逆境胁迫下,AmPAL基因抗逆性与膜脂抗氧化性存在互作关系;AmPAL基因对烟草营养生长和生殖生长都产生了影响。
刘锦红,李思敏,王紫莹,生书晶[2]（2020）在《基因工程在药用植物研究中的应用及其发展前景》文中指出随着药用植物的社会需求不断增加,资源短缺和品质退化成为限制药用植物快速发展的瓶颈问题,基因工程可以有效提高药用植物的产量和品质。综述了基因工程在提高药用植物次生代谢产物含量、提高抗逆性、生物转化以及药用植物品种改良等方面的应用,同时对药用植物基因工程存在的问题进行了分析。
陈秀珍[3]（2020）在《广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究》文中提出广藿香（Pogostemon cablin（Blanco）Benth.）是着名的岭南道地药材,十大广药之一,是临床常用的芳香化湿药。从广藿香中提取的广藿香油是医药工业和轻化工业的重要原料,市场需求量大。广藿香是获得广藿香油的唯一天然来源,其最主要的成分是广藿香醇（Patchoulol）,又称为“百秋李醇”,是一种代表性的倍半萜类物质,具有很好的神经保护、抗流感病毒、抗多种真菌、抗肿瘤、抗炎症等生物活性,更是我国历版药典中用于评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分。因此,广藿香醇的生物合成及其动态积累研究备受关注。随着功能基因组学、植物代谢检测分析技术和多组学技术的应用,广藿香萜类次生代谢模式和广藿香醇的生物合成途径被逐渐解析。研究表明,广藿香醇合酶（Patchoulol synthase,PatPTS）能直接催化法呢基焦磷酸（FPP）生成倍半萜类终产物广藿香醇,对于广藿香醇的合成积累最为关键。目前对广藿香的萜类合成在转录调控方面的研究尚没有报道,特别是缺乏直接剖析转录因子如何调控PatPTS的转录表达的研究,相关的转录调控机制和互作网络也未得到解析。因此,本研究率先开展了调控广藿香醇生物合成的转录因子的挖掘,采用三代测序技术构建了广藿香全长转录本数据库,结合酵母杂交技术,以PatPTS的启动子作为靶调控位点,通过文库筛选、分离克隆和体内外验证来获得一系列转录因子,并联合植物基因工程和代谢分析对其功能进行深入研究,以阐明广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制,为广藿香优良品种培养及广藿香醇合成研发工作提供理论支撑和技术参考。研究的技术方法和结果概况如下:1广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析1.1基于PacBio三代测序的转录本识别和分析采用PacBio单分子实时测序技术（Singlemolecular real-time,SMRT）构建了广藿香全长转录组参考图谱,重构获得了 82,335个全长转录本,共有65,826个转录本在Nr、Swissprot、GO、KEGG等数据库获得注释,注释率为79.95%。其中注释为萜类生物合成相关途径相关的转录本有103个,共包括广藿香醇合成相关关键酶基因16个,并分析获得3,176个转录因子序列,分别属于90个不同的家族。1.2酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析利用 Invitrogen 的 CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Kit 构建来广藿香高质量酵母杂交cDNA文库,其库容为8.6×106CFU,重组率为>95%,满足次级文库要求,可用于后续文库筛选试验。2 PatPTS启动子克隆及其转录调控因子的筛选2.1 PatPTS及其启动子的克隆分析从广藿香转录组数据库筛选获得PatPTS的全长转录本,设计引物克隆获得PatPTS基因1,659 bp ORF序列和3,392 bp gDNA序列,以及854 bp启动子序列。采用PlantCARE和New PLACE等数据库对该启动子进行顺式作用元件分析,发现该启动子含有转录起始核心元件TATABOX、增强子核心元件CAATBOX等必须元件,同时含有E-BOX、I-BOX等多种转录因子的结合元件,还含有JA、ABA、Ethylen（乙烯,ET）等激素响应元件。2.2结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选以PatPTS的启动子为诱饵从广藿香cDNA文库中获得约200个候选基因片段。通过NCBI、Uniprot等数据库进行候选片段注释分析,从广藿香的全长转录本数据库提取候选基因的全长转录本进行分析及克隆;然后构建酵母AD载体,并与诱饵质粒共转至酵母Y187重复酵母单杂交验证,结果表明 PatDREB、PatERF061、PatSWC4、PatASIL2、PatGATA17和PatGIS2等6个蛋白在酵母体内可以结合PatPTS的启动子。3转录因子调节PatPTS基因表达参与广藿香醇合成调控的机制3.1广藿香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究（1）据文献报道MYC2转录因子在植物萜类化合物的代谢合成中具有重要的调控作用,因此本研究还对广藿香中MYC2转录因子进行了克隆,并探究其对PatPTS的转录调控功能进行分析。从广藿香的全长转录组数据库筛选出1 1条注释为MYC的全长转录本,设计引物克隆获得8个MYC编码序列,对序列进行生物信息学分析表明PatMYC2a、PatMYC2b1和PatMYC2b2具有高度保守bHLH-MYC-N、bHLH-Zip和ACT-like功能域。这3个PatMYC2在拟南芥原生质体中均定位于细胞核,均具有转录激活活性,缺失表达实验表明PatMYC2a和PatMYC2b2的转录激活功能域为bHLH-MYC-N蛋白保守结构。RT-qPCR分析表明3个PatMYC2在不同组织部位均有表达,低温和光照处理后3个PatMYC2呈现相似的表达模式。（2）在本氏烟中进行的双荧光素酶（Dual-luc）实验和在广藿香叶片中瞬时过表达实验表明分别过表达PatMYC2a和PatMYC2b2能够激活PatPTS启动子的活性并促进PatPTS基因转录表达,同时可激活广藿香醇合成通路PatFPPS、PatIPPI、PatMVD、PatPMK、PatHMGS和PatAACT等多个关键酶基因的表达来促进叶片中广藿香醇的合成积累。3.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广藿香醇合成调控机制研究（1）Y1H实验中筛选得到的两个AP2/ERF家族转录因子均含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域,均属于DREB亚家族,具有该亚家族的保守位点,其中PatDREB属于该亚族A-4组,PatERF061则属于A-6组。PatDREB在拟南芥原生质体的细胞核定位表达,而PatERF061则在细胞核和细胞质均有表达。两个DREB在不同组织均有表达,且转录表达水平受MeJA诱导,但表达模式有所差异。（2）酵母双杂交（Y2H）和荧光素酶互补（BiFC）实验结果表明,PatDREB和PatERF061分别能与茉莉酸信号通路的抑制蛋白PatJAZ4互作,而PatERF061能与PatJAZ4在拟南芥原生质体的细胞核共表达。Dual-luc实验进一步表明,PatDREB和PatERF061能显着激活PatPTS启动子的活性,它们的转录调控功能受PatJAZ4和MeJA水平影响,其中PatJAZ4通过与PatERF061结合而抑制其转录调控功能,而MeJA能够逆转这种抑制作用。外源MeJA能够抑制PatDREB转录调控功能,而PatJAZ4对PatDREB的转录功能影响不大。（3）广藿香叶片瞬时过表达实验表明,PatDREB和PatERF061均能通过激活广藿香醇合成途径的关键酶基因的表达,从而促进广藿香醇的合成积累。PatERF061与PatJAZ4共过表达则抑制广藿香醇的合成积累,与dual-luc结果一致。说明PatDREB和PatERF061是促进广藿香醇合成的重要转录因子,而且是茉莉酸信号通路的重要组分。3.3 MYBrelated转录因子PatSWC4调控广藿香醇合成机制研究（1）Y1H筛选获得的PatSWC4为MYBrelated家族转录因子,含有SANT/Myb-like domain of DAMP 1 和 DNA methyltransferase 1-associated protein 1（DMAP1）两个保守功能域。PatSWC4主要于细胞核定位表达,在广藿香各个组织部位均有表达,且其转录表达水平受MeJA诱导。Y2H和Dual-luc实验结果表明,PatSWC4能激活PatPTS启动子的活性,添加MeJA后,激活作用更显着提高;PatJAZ4通过与PatSWC4结合而抑制其转录激活功能,而施加MeJA则能逆转这种抑制作用。在广藿香叶片中瞬时过表达PatSWC4,能激活广藿香醇合成酶PatPTS和MVA途径PatFPPS等关键酶基因的表达;另外广藿香醇合成相关转录因子PatDREB、PatERF061和3个PatMYC2的表达也显着提高,从而促进了叶片中广藿香醇的合成和积累。（2）Y2H 和 Dual-luc 实验表明 PatSWC4 能分别与 PatDREB、PatERF061形成转录复合体,复合体能激活PatPTS的启动子活性,外源MeJA能抑制其激活作用。PatJAZ4能分别与PatSWC4、PatDREB、PatERF061结合,抑制转录复合体的形成,从而抑制PatPTS启动子的活性,这种作用在施加MeJA后可消除,甚至逆转。将PatSWC4分别与PatDREB、PatERF061在广藿香叶片中进行瞬时共过表达,也能显着促进广藿香醇的合成和积累。3.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广藿香醇合成机制研究（1）是Trihelix家族SIP1亚家族转录因子,N端有一个Trihelix保守结构域和一个第四α螺旋结构域,C端有一个卷曲螺旋结构域。预测发现在蛋白序列的中、下游共有两个核定位信号（NLS）,PatASIL2在拟南芥原生质体亚细胞定位于细胞核,与预测一致。PatASIL2在不同的组织均有表达,且转录表达水平受MeJA的诱导。Dual-luc实验表明PatASIL2能抑制PatPTS启动子活性,施加MeJA后,PatASIL2则激活PatPTS启动子转录活性。广藿香叶片瞬时过表达PatASIL2能促进广藿香醇的合成和积累,激活广藿香醇合成途径PatFPPS、PatMVD等多数关键酶基因的表达,但抑制PatPTS的表达。（2）Y2H 和 BiFC 实验,表明 PatASIL2 能分别与 PatDREB、PatERF061 在细胞核形成转录复合体。PatASIL2分别与两个DREB瞬时共过表达都能促进广藿香叶片中广藿香醇的合成和积累。说明PatASIL2为广藿香醇合成的重要调控因子,且能与两个DREB形成转录调控复合体。3.5两个锌指蛋白可能调控广藿香醇的合成酵母单杂交筛选获得的PatGATA17和PatGIS2均为锌指蛋白。PatGATA17属于Zf-GATA转录因子家族,主要于细胞核表达;具有转录激活活性。该基因在广藿香根和成熟叶表达量较高,且受MeJA和低温诱导。PatGATA17能够结合PatPTS的启动子并激活其转录活性,进而促进广藿香醇的合成积累。而PatGIS2属于Zf-CCHC基因家族,通过结合PatPTS的启动子并抑制其转录活性,进而抑制广藿香醇的合成积累。综上所述,为挖掘鉴定广藿香醇生物合成的转录调控因子,本研究首先构建了广藿香的全长转录组和酵母杂交文库,根据转录组注释分离克隆了广藿香MYC2转录因子,并研究其在广藿香醇生物合成中的重要作用,以PatPTS的启动子为诱饵筛选并首次鉴定了 6个特异性调控PatPTS基因表达进而参与调控广藿香醇生物合成的转录因子,并利用瞬时过表达对其功能进行验证分析。PatDREB、PatERF061、PatSWC4和PatASIL2的基因表达和转录调控功能受外源MeJA诱导,可能为JA信号通路的下游响应转录因子。蛋白互作结果还表明两个DREB转录因子能够与MYB-like转录因子（PatSWC4、PatASIL2）形成转录复合体调控广藿香醇的合成。同时PatGATA17和PatGIS2作为调控广藿香醇合成的候选转录因子开展初步鉴定。本研究首次筛选获得多个转录因子,功能分析揭示了其调控广藿香醇生物合成的可能模型,不仅促进从转录调控上揭示广藿香醇的生物合成分子机制,在广藿香响应激素诱导的分子调控网络机理的解析取得突破,而且有助于广藿香及广藿香挥发油的质量控制,为利用代谢调控手段提高药用植物活性成分合成提供理论基础和应用借鉴。
李玉婵[4]（2020）在《农杆菌介导的北柴胡遗传转化体系的建立》文中认为柴胡是我国着名大宗药材,以根入药,药用价值极高,化学活性成分复杂丰富,其中柴胡皂苷是柴胡类抗炎药的主要药效成分,其在侧根中含量显着高于主根中含量。近年来,使用基于生物技术的育种方法已成为选育药用植物最新方向之一,而农杆菌介导的基因转化是直接依赖于植物组织培养的主要生物技术育种方法。本课题组前期对北柴胡中侧根形成相关基因进行克隆研究后发现,生长素响应基因（auxin-responsive,AUX/IAA）家族中的BcIAA13在侧根形成前后表达量的变化趋势一致,侧根形成后表达量逐渐降低,推测BcIAA13参与调控北柴胡侧根发生发育的过程。本研究以北柴胡叶片、茎段、下胚轴为外植体优化北柴胡的离体再生体系,同时构建pCAMBIA1301-BcIAA13植物超表达载体,利用根癌农杆菌对北柴胡进行遗传转化体系初步研究,研究对验证相关功能基因在柴胡生长发育过程中发挥的作用具有重要意义。主要研究结果如下:（1）北柴胡离体组织再生体系优化设置多种诱导配方对北柴胡叶片、茎段、下胚轴进行愈伤组织诱导,试验获得优化再生体系结果为:主要外源激素为2,4-D、TDZ、6-BA等,其中适宜于柴胡叶片、下胚轴、茎段CN的愈伤组织诱导配方是含有2.0mg/L 2,4-D和1.0mg/L TDZ的MS培养基;茎段N的最佳愈伤诱导培养基为MS+1mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+0.5mg/L6-BA+4g/L植物凝胶+30g/L蔗糖。北柴胡下胚轴愈伤组织的不定芽分化率最高,分化率为73.58%,出苗率为54.72%,分化培养基为:MS+0.5mg/L KT;不定芽生根培养中:IBA生长激素不定根诱导效果最好,其中MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶4g/L是柴胡生根的最佳培养基,诱导不定根数10根,根长3.63cm。（2）pCAMBIA1301-BcIAA13植物表达载体的构建以“川北柴1号”幼苗为植物材料提取得到高质量RNA逆转录得到北柴胡cDNA,并通过PCR克隆获取到目的基因BcIAA13,成功构建pCAMBIA1301-BcIAA13植物表达载体。（3）北柴胡BcIAA13基因生物信息学分析对北柴胡BcIAA13基因进行生物信息学分析的结果表明:北柴胡BcIAA13基因序列与胡萝卜生长素调控蛋白IAA13基因序列覆盖度到达71%,相似性高达80%。该基因编码313个氨基酸是结构稳定的酸性蛋白,不存在跨膜区域,具有亲水性,二级结构中含量最高的为β折叠,占全部序列的24.92%,主要存在于植物细胞质间。序列分析结果表明,该基因属于AUX/IAA超级家族,具有AUX/IAA结合结构域I,II,III,IV。进化树聚类分析表明北柴胡BcIAA13基因与胡萝卜亲缘性最近。（4）农杆菌介导的北柴胡遗传转化体系的初步研究利用根癌农杆菌介导法,通过筛选抗生素潮霉素适宜浓度、菌液浓度、共培养时间、外植体种类建立起北柴胡的遗传转化体系。获得转化条件为:侵染菌液OD600≈0.6,侵染时间为10min,共培养2d,潮霉素筛选浓度为25mg/L。其中下胚轴的转化效率最高,抗性愈伤率为46.55%。
任风鸣[5]（2019）在《罂粟科植物毛黄堇分子鉴定、活性成分及肝保护作用研究》文中进行了进一步梳理毛黄堇Corvdalis tomentella Franch.为磐粟科紫堇属植物,民间作为治疗肝炎和肝硬化的特效草药使用,疗效显着。但其化学成分尚不明确,药理作用缺乏基础数据,药材鉴定缺乏有效手段,严重制约其临床应用。本研究基于本草基因组学、植物化学及中药药理学的方法和技术,对毛黄堇药材鉴定、活性成分及肝保护作用开展研究。为药材质量控制及临床应用提供依据,对人工栽培、重要化合物生物合成具有指导意义。主要研究结果如下:1.采用紫堇属最大样本量开展毛黄堇及同属物种DNA条形码鉴定研究,结果显示DNA条形码能有效鉴定毛黄堇与同属物种。从5条（ITS,ITS2,matK,rbcL和psbA-trnH）核基因组及叶绿体基因组DNA条形码序列中,初步筛选出鉴定效率较高的3条（ITS,ITS2,matK）,基于毛黄堇及同属131个样本进一步评估鉴定效率最高的条形码及分析方法。结果显示,DNA条码对毛黄堇及其同属物种鉴定效率最高为69.6%。单序列中,ITS（65.2%）鉴定效率最高;单序列及复合序列中,ITS+matK（69.6%）鉴定效率最高;比较各分析方法,BLAST提供最高鉴定效率,DNA条形码能有效鉴定毛黄堇与同属物种。聚类分析显示,毛黄堇与石生黄堇亲缘关系最近。2.高通量测序紫堇属首个叶绿体基因组,有效鉴定毛黄堇与石生黄堇。Illumina HiSeq4000高通量测序平台测序毛黄堇及同属近缘种石生黄堇叶绿体基因组,组装获得190kb的毛黄堇叶绿体基因组和189kb的石生黄堇叶绿体基因组。总计注释107个叶绿体基因,包括73个蛋白质编码基因、25个tRNA和4个rRNA基因。毛黄堇叶绿体基因组具有较为特殊的结构,高度扩增的IR区和极度收缩的SSC区（9636bp）,以及高比例的散在和串联重复序列。通过叶绿体基因组全局比对和提取70个共有蛋白编码基因序列建立系统进化树,能有效鉴定毛黄堇与近缘种石生黄堇。3.高通量测序毛黄堇核基因组,组装获得高质量基因组。PacBio Sequel三代测序平台7个SMRT cells共测序产生27.64 Gb（约107×）原始数据,过滤后N50为9.63 kb。Survey分析显示,毛黄堇基因组约258.56Mb,具有非常低的杂合度（约0.3%）。最终组装生成252Mb的基因组,Contig N50为2.36Mb,覆盖预测基因组97.3%,BUSCO评估显示毛黄堇基因组完整性95.70%。共注释到25,595个基因座位,编码36177个蛋白质,43.54%（110,107,533bp）的重复序列,BUSCO评估毛黄堇蛋白编码序列注释完整性84.8%。CAFE分析显示,毛黄堇扩张基因1374个,收缩基因2532个。根据tune tree的标准生物钟以及系统发育树的进化节点计算分化时间,毛黄堇与博落回聚在一枝,其分化时间大约为36.48百万年前。13C稳定同位素标记酪氨酸培养毛黄堇植株,HPLC-Q/TOFMS检测代谢通路中化合物同位素标记。结果显示,关注通路中22个化合物中21个检测到被同位素标记,标记的形式与预测通路中化合物代谢规律一致,证实毛黄堇中脱氢卡维丁等生物碱合成上游途径与酪氨酸途径合成异喹啉生物碱一致。结合化合物结构、酶特性及同位素示踪,推测从已知途径终产物金黄紫堇碱起始,经过2步脱氢酶和2步甲基转移酶催化合成脱氢卡维丁。从毛黄堇基因组中,筛选到与脱氢卡维丁等生物碱合成相关22个关键酶同源基因,根、茎、叶、花不同部位转录组和生物碱含量分析显示,关键酶基因表达与生物碱含量具有一定相关性。4.从毛黄堇总生物碱中首次分离、鉴定6个生物碱成分。75%乙醇回流提取毛黄堇总生物碱,制备液相色谱仪分离、制备单体生物碱成分,UPLC-ESI-Q-TOF-MS液质联用仪,AM600型核磁共振仪鉴定化合物结构。共分离得到6个单体成分,鉴定为:脱氢卡维丁、脱氢阿卜卡维丁、脱氢异阿卜卡维丁、黄连碱、脱氢碎叶紫堇碱和甲基黄连碱,6个化合物均为首次从毛黄堇中分离。不同部位毛黄堇药材化学成分差异显着,其主要活性成分脱氢卡维丁在花和根中含量较高,茎、叶中偏低,黄连碱特异性分布在花中。野生和人工栽培毛黄堇化学成分差异不显着,表明人工栽培药材可以作为野生药材的替代品。不同采收期化学成分差异显着,3月采收毛黄堇主要化学成分含量最高。5.研究表明毛黄堇具有显着的酒精性急性肝损伤保护作用。采用酒精所致小鼠急性肝损伤及四氯化碳所致急性肝损伤模型对毛黄堇水提物肝保护活性进行评价。结果显示,毛黄堇水提物各剂量组（200 mg/kg.400 mg/kg、600 mg/kg）均能显着降低酒精所致急性肝损伤小鼠ALT和AST酶活性（P<0.01,P<0.05）,减轻肝组织受损程度,对酒精性急性肝损伤具有保护作用。四氯化碳急性肝损伤结果显示,毛黄堇水提物在低剂量（200 mg/kg）时对四氯化碳所致急性肝损伤小鼠ALT活性有微弱的抑制作用。本研究以疗效确切的传统中草药毛黄堇为研究对象,为药材鉴定提供有效方法,揭示其药效物质基础,明确其主要药理活性,为毛黄堇药材地方和国家用药标准制定提供科学依据。
陈士林,吴问广,王彩霞,向丽,师玉华,张栋,胡灏禹[6]（2019）在《药用植物分子遗传学研究》文中认为随着现代生物技术的发展,药用植物分子遗传学研究逐步成为学术界的热点。该文首次提出了药用植物分子遗传学的研究体系,从遗传资源、基因组、基因功能和研究方法方面阐述了药用植物分子遗传学体系的基础;探讨了药用植物品种鉴定、分子育种以及生物合成方面的主要应用范围;指出药用植物分子遗传学的主要研究方向,重点推进千种草药基因组计划,建立以药用模式物种及突变体库为主体的功能基因研究平台,构建药用植物活性成分异源合成体系基因原件库及专一底盘细胞,通过分子育种培育高有效成分高抗性的药用植物新品种等。
张洋,洑香香,尚旭岚[7]（2018）在《药用植物生产体系构建——生物技术的应用》文中研究说明长久以来,我国依赖药用植物防治疾病。但随着人口激增、生境破坏,致使药用植物野生资源锐减、质量下降,缓解药用植物供需压力是目前亟需解决的民生问题。生物技术在药用植物方面应用广泛,该文介绍了药用植物离体再生研究现状、次生代谢产物生产技术、组培材料稳定性鉴定方法;分析了木本药用植物离体再生体系建立的困难所在;比较了现有代谢产物生产技术的优缺点;强调了组培材料稳定性鉴定的重要性;揭示了转基因技术在药用植物体系构建的广阔前景。
任子豪[8]（2017）在《药用植物对干旱胁迫响应的研究进展》文中指出本文从生长发育、生理生化反应、应答机制等方面综述了近年来药用植物对干旱胁迫响应的研究进展,并初步总结了应用基因工程技术提高药用植物抗旱性的成果,为深入研究药用植物与干旱胁迫的关系以及解决药用植物实际生产中所面临的干旱问题提供理论依据。
武超[9]（2016）在《短小蛇根草WRKY转录因子的克隆与功能初步研究》文中进行了进一步梳理短小蛇根草（Ophiorrhiza pumila）,隶属茜草科（Rubiaceae）蛇根草属（Ophiorrhiza）,是一种一年生双子叶草本植物,全草含抗癌药物喜树碱及其衍生物。但药源的短缺成为研发和应用喜树碱类化合物的巨大瓶颈,植物次生代谢工程的发展为解决药源短缺,提高药用成分含量奠定了基础。本研究在短小蛇根草悬浮细胞,根,毛状根的转录组测序的基础上,应用系统生物学手段,挖掘参与调控喜树碱生物合成的转录因子并进行功能的初步研究,为获得高产喜树碱的毛状根品系提供代谢工程新策略。研究结果如下:（1）通过短小蛇根草转录组数据注释,共获得了34个Op WRKYs（Op WRKY1-34）,根据比较基因组学方法,建立在根,毛状根和细胞悬浮培养液中差异表达的有转录因子库,其中WRKY转录因子14条。（2）获得短小蛇根草WRKY转录因子基因家族的全部成员,并进行系统进化特征、结构特征、组织表达特征以及关联性网络特征分析,发现Op WRKY1、Op WRKY2、Op WRKY23、Op WRKY28和Op WRKY33差异基因位于该关联性网络的核心位置,并确定为候选基因。（3）建立短小蛇根草毛状根在摇瓶培养中不同时期WRKY转录因子的表达体系与喜树碱及其中间代谢产物的变化体系,利用Person检验计算出相关系数r,并制作出“基因-化合物”关联图,发现三类WRKY转录因子（Op WRKY1和Op WRKY3）对喜树碱及其中间产物有调控作用。（4）组织表达谱显示三个WRKY转录因子均在茎中表达最高;诱导表达谱分析显示三个WRKY转录因子受多种激素的诱导,其中对于SA,ASA和ACC的响应均较为剧烈。亚细胞定位结果显示三个WRKY转录因子蛋白均在细胞核中表达。（5）获得三个WRKY转录因子的过表达和抑制表达的转基因阳性毛状根,经q RT-PCR及HPLC分析表明,Op WRKY1转录因子可能通过抑制Op CPR基因的表达,抑制喜树碱的合成,是一个负调节因子。Op WRKY2可能通过促进Op CPR,Op TDC和Op SGD基因的表达,促进喜树碱的合成,是一个正调节因子;Op WRKY3可能是一个毛状根发育生长的调控因子。（6）毛状根中喜树碱的共聚焦显微镜观察分析,我们进一步证实了喜树碱在毛状根中的合成部位是根尖外周皮,进一步确定了Op WRKY1负调控喜树碱的积累;Op WRKY2正调控喜树碱的积累;Op WRKY3调控根尖的发育。
周萍[10]（2016）在《明党参悬浮培养体系的建立及香豆素含量的调控研究》文中指出明党参Changium smyrnioides Wolff.是我国特有的伞形科（Umbelliferae）单种属植物,为《药典》收载的名贵中药材。由于明党参的用途广泛,因而人们对其过度采挖,其野生资源逐年减少,再加明党参种群自身恢复能力差,导致明党参成为濒危珍稀植物。现代研究发现明党参根皮中含有较为丰富的呋喃香豆素,如异欧前胡素、欧前胡素、花椒毒酚、珊瑚菜内酯、补骨脂素、佛手柑内酯等,而呋喃香豆素类成分具有影响药物代谢酶、抗HIV病毒、抗肿瘤、光化学作用等多种药理作用。通过明党参植物细胞悬浮培养生产香豆素及进行悬浮细胞中香豆素产量的调控研究,旨在保护明党参资源同时获得了大量有效的次生代谢产物。主要研究内容及结果如下。1、文献综述。分述了了近年来我国药用植物组织培养生产次生代谢产物的研究进展及明党参的研究进展。探讨了药用植物组织培养生产次生代谢产物的种类、产量及提高次生代谢产物的方法;概述了明党参的生物学特性、濒危原因及其组织培养研究进展。为后续实验提供理论依据。2、悬浮细胞培养体系的建立。在查阅文献的基础上对明党参叶片、叶柄、茎三种外植体进行了愈伤组织诱导,筛选出了适合进行悬浮培养的愈伤组织。最终选择外植体叶片诱导的明党参细胞株进行悬浮培养,以生物量、总香豆素的产量为指标,优化了明党参细胞培养过程中培养基、接种量、蔗糖添加量、培养温度等条件,建立了明党参细胞悬浮培养体系。结果为选取3%的明党参细胞接种于MS液体培养基（NAA1.5 mg·L-1+2，4-D0.5 mg·L-1+KT0.2 mg· L-1+6-BA0.5 mg· L-1+3%蔗糖）,25℃,转速120r·min-1,共培养 20d。3、悬浮细胞培养模式的优选。在培养基种类对明党参细胞影响的基础上,对明党参悬浮细胞采用二步法培养,以悬浮细胞生物量、总香豆素积累量及两种呋喃香豆素（佛手酚、佛手柑内酯）含量为指标,考察明党参悬浮细胞的最佳培养模式。结果明党参悬浮细胞采用二步法培养后的第20 d,生物量的积累达到最大值179个/μL,比只使用MS培养基的细胞数目提高了 12.6%,第24 d总香豆素积累量达到最大值0.2882 mg·L-1比只使用White培养基的中总香豆素含量提高了 60.7%,细胞中佛手酚、佛手柑内酯含量达到了1.79%、0.36%,,比一步法提高了 1.75 倍和 28.6%。4、抗褐化剂的优选。寻找解决明党参悬浮细胞培养过程中出现的褐化现象的方法,探讨不同抗褐化剂对明党参悬浮细胞数目、发生褐化反应底物酚类及明党参的有效成分香豆素的影响。本章实验在轻度褐化的明党参悬浮细胞中添加不同浓度的抗坏血酸（AsA）、酸水解酪蛋白（AHC）、活性炭（AC）、硫代硫酸钠（Na2S2O3）以及聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,利用紫外分光光度法和高效液相色谱法检测酚类、总香豆素,佛手酚及佛手柑内酯含量。结果为用2 mg·mL-1的AsA处理后,总香豆素含量提高了 60.90%,将该浓度AsA添加到以水杨酸作为诱导子的明党参悬浮培养液中,改善了水杨酸的促进褐化现象,同时佛手酚、佛手柑内酯的含量提高了 20.61%、25.00%。AsA为明党参悬浮细胞培养的最佳抗褐化剂,在抑制悬浮细胞褐化的同时,有效地促进细胞生长和次生代谢产物的积累。5、提高呋喃香豆素生物合成含量诱导子的优选。考察了水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、酵母浸出物（YEF）3种诱导子及前体物质L-苯丙氨酸（PHE）等对明党参悬浮细胞生长和呋喃香豆素合成的影响。在悬浮细胞稳定期加入不同浓度的诱导子及前体物质,以明党参细胞生物增长量、悬浮细胞内外呋喃香豆素积累为指标,以期得到最适明党参细胞的诱导子,得出最佳添加浓度及诱导时间。结果为SA、MeJA两种诱导子对明党参悬浮细胞中的佛手酚、佛手柑内酯和花椒毒素三种呋喃香豆素的合成有明显的促进作用,其中200μmol·L-1的SA诱导的明党参悬浮细胞中的三种呋喃香豆素含量达到了 0.654%、0.293%、0.060%,生物量比对照组提高了 42.14%,确立了诱导子最佳诱导时间为8 d。
二、基因工程技术提高药用植物次生物质产量研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因工程技术提高药用植物次生物质产量研究进展（论文提纲范文）
（1）黄耆苯丙氨酸解氨酶基因（AmPAL）参与植物抗逆性的功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 盐碱及干旱胁迫对植物影响的研究进展 |
| 1.1.1 盐碱及干旱胁迫对种子萌发的影响 |
| 1.1.2 盐碱和干旱胁迫对植物生长的影响 |
| 1.1.3 盐碱及干旱胁迫对植物生理生化的影响 |
| 1.2 盐碱及干旱胁迫相关功能基因的研究进展 |
| 1.2.1 盐碱胁迫相关基因 |
| 1.2.2 干旱胁迫相关基因 |
| 1.3 黄耆研究现状 |
| 1.3.1 黄耆资源的分布 |
| 1.3.2 黄耆繁殖、栽培技术研究 |
| 1.3.3 黄耆育种研究 |
| 1.3.4 黄耆的园林应用 |
| 1.3.5 其它 |
| 1.4 PAL的研究现状 |
| 1.4.1 PAL的分布与基因家族 |
| 1.4.2 PAL蛋白的特性和功能 |
| 1.4.3 PAL的调节机制 |
| 1.4.4 PAL的作用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 AmPAL基因表达特性及蛋白亚细胞定位 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂及药品 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 AmPAL基因克隆 |
| 2.2.2 构建黄耆PAL系统进化树 |
| 2.2.3 AmPAL基因表达特性分析 |
| 2.2.4 AmPAL蛋白亚细胞定位研究 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 AmPAL基因克隆 |
| 2.3.2 AmPAL结构域和系统进化树 |
| 2.3.3 盐碱、ABA、PEG6000胁迫下AmPAL表达特性分析 |
| 2.3.4 AmPAL蛋白亚细胞定位 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 AmPAL基因对烟草的遗传转化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试剂及药品 |
| 3.1.3 遗传转化的菌株和二元植物载体 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 AmPAL植物表达载体的构建 |
| 3.2.3 重组pCXSN-AmPAL质粒的农杆菌转化及分子鉴定 |
| 3.2.4 农杆菌介导法转化烟草 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 AmPAL基因的植物表达载体构建 |
| 3.3.2 PCR检测转化株系 |
| 3.3.3 Southern鉴定 |
| 3.3.4 Northern转录表达水平鉴定 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 过表达AmPAL基因烟草对盐碱及干旱胁迫的抗性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 过表达AmPAL基因烟草2叶龄幼苗抗盐(NaCl)性分析 |
| 4.2.2 过表达AmPAL基因烟草5叶龄幼苗抗盐碱及干旱分析 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 异源超表达AmPAL基因烟草表型分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 异源超表达AmPAL基因烟草形态学变化观测 |
| 5.2.2 异源超表达AmPAL基因烟草的生长发育状况 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 NtPAL基因启动子序列分析及其蛋白功能分析 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 黄耆PAL基因与烟草PAL基因同源性比对 |
| 6.2.2 烟草PAL基因启动子顺式作用元件分析 |
| 6.2.3 Tbtools可视化作图 |
| 6.2.4 转录因子预测分析 |
| 6.2.5 蛋白互作预测网络构建及功能分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 黄耆PAL基因与烟草PAL基因同源性比对 |
| 6.3.2 烟草NtPAL基因启动子区域软件预测分析 |
| 6.3.3 转录因子预测 |
| 6.3.4 NtPAL蛋白互作网络分析 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 AmPAL基因对矮牵牛和细叶百合的遗传转化 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 菌株与试剂 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 AmPAL植物表达载体的构建及农杆菌转化 |
| 7.2.2 工程菌的培养 |
| 7.2.3 受体材料的获得 |
| 7.2.4 pCXSN-AmPAL转化矮牵牛 |
| 7.2.5 pCXSN-AmPAL转化细叶百合 |
| 7.2.6 抗性转化植株的分子检测 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 转化矮牵牛的再生植株 |
| 7.3.2 转AmPAL基因细叶百合的抗性筛选 |
| 7.3.3 转AmPAL矮牵牛植株的PCR检测 |
| 7.3.4 转AmPAL细叶百合植株的PCR检测 |
| 7.3.5 qPCR检测AmPAL在转基因细叶百合中的表达量 |
| 7.4 本章小结 |
| 8 讨论 |
| 8.1 AmPAL基因表达特性及蛋白亚细胞定位 |
| 8.2 AmPAL基因对烟草的遗传转化 |
| 8.3 过表达AmPAL基因烟草对盐碱及干旱胁迫的抗性研究 |
| 8.4 异源超表达AmPAL基因烟草表型分析 |
| 8.5 NtPAL启动子、转录因子预测及互作蛋白网络预测 |
| 结论 |
| 建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基因工程在药用植物研究中的应用及其发展前景（论文提纲范文）
| 1 提高次生代谢产物的含量 |
| 2 提高药用植物的抗逆性 |
| 3 生物转化 |
| 4 药用植物品种改良 |
| 5 药用植物基因工程存在的问题及对策 |
（3）广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 广藿香和广藿香油 |
| 1.2 广藿香萜类生物合成的研究概况 |
| 1.3 植物萜类次生代谢的转录调控研究概况 |
| 1.4 转录因子调控药用植物萜类代谢物合成的研究进展 |
| 2 立题依据及研究思路 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 研究思路 |
| 2.3 技术路线 |
| 第二章 广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析 |
| 1 基于PacBio三代测序的转录本识别和分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 小结与讨论 |
| 2 酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 广藿香醇合酶(PatPTS)启动子克隆及其转录调控因子的初步筛选和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广藿香醇合酶(PatPTS)及其启动子的克隆分析 |
| 2.2 结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 调控广藿香醇生物合成的转录因子的表达及功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广藿香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究 |
| 2.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广藿香醇合成调控机制研究 |
| 2.3 MYB related转录因子PatSWC4调控广藿香醇合成机制研究 |
| 2.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广藿香醇合成机制研究 |
| 2.5 两个参与调控广藿香醇合成的锌指蛋白 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 1 结论 |
| 2 综合讨论 |
| 2.1 两个DREB功能和调控机制差异 |
| 2.2 广藿香MYC2转录因子的结构与功能 |
| 2.3 转录复合体在广藿香醇生物合成的复杂调控机制 |
| 2.4 茉莉酸信号介导的广藿香醇合成转录调控机制探讨 |
| 2.5 参与调控广藿香醇合成转录因子在植物代谢工程的利用 |
| 3 创新点 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 miRNA前体预测结果 |
| 附录2 萜类合成通路相关转录本汇总表 |
| 附录3 本研究所用引物列表 |
| 附录4 全长转录组中PatPTS全长转录本 |
| 附录5 MYC转录因子同源比对 |
| 附录6 GIS2的同源蛋白 |
| 附录7 图表目录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 参与课题 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详情摘要 |
（4）农杆菌介导的北柴胡遗传转化体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1.绪论 |
| 1.1 柴胡的研究进展 |
| 1.1.1 柴胡的传统应用 |
| 1.1.2 柴胡活性成分及药理作用研究 |
| 1.2 IAA/AUXs家族研究进展 |
| 1.2.1 生长素简介 |
| 1.2.2 植物Aux/IAA蛋白的分子结构 |
| 1.2.3 植物Aux/IAA蛋白的相互作用 |
| 1.2.4 Aux/IAA基因家族在植物生长发育过程中的功能作用 |
| 1.3 遗传学和生物技术在药物植物改良中的应用 |
| 1.3.1 药用植物快速改良的主要途径 |
| 1.3.2 药用植物的组织培养 |
| 1.3.3 代谢途径工程与毛状根 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料: |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 仪器与试剂 |
| 2.1.4 试验试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 北柴胡离体组织再生体系优化 |
| 2.2.2 目的基因获取及克隆 |
| 2.2.3 构建BcIAA13-pCAMBIA1301 植物表达载体 |
| 2.2.4 根癌农杆菌介导的北柴胡的遗传转化 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 消毒时间对茎段培养的影响 |
| 3.2 愈伤组织诱导 |
| 3.2.1 不同激素配比对叶片愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.2 不同激素配比对北柴胡不同器官愈伤组织诱导的影响 |
| 3.3 愈伤组织分化 |
| 3.3.1 不同激素配比对柴胡叶片愈伤组织分化的影响 |
| 3.3.2 不同北柴胡器官对不定芽分化影响 |
| 3.4 不定芽的生根诱导 |
| 3.5 目的基因的克隆及测序 |
| 3.5.1 北柴胡总RNA的提取 |
| 3.5.2 c DNA验证 |
| 3.5.3 克隆载体菌液PCR检测 |
| 3.6 北柴胡Bc IAA13 基因生物信息学分析 |
| 3.6.1 北柴胡Bc IAA13 碱基序列同源对比分析 |
| 3.6.2 北柴胡Bc IAA13 氨基酸序列同源性比对分析 |
| 3.6.3 北柴胡Bc IAA13 氨基酸保守结构域分析 |
| 3.6.4 北柴胡Bc IAA13 蛋白质一级结构预测分析 |
| 3.6.5 北柴胡Bc IAA13 蛋白质二级结构预测分析 |
| 3.6.6 北柴胡Bc IAA13 蛋白质三级结构预测及亚细胞定位预测 |
| 3.6.7 北柴胡Bc IAA13 蛋白质跨膜区及亲水性预测分析 |
| 3.7 构建pCAMBIA1301-BcIAA13 表达载体 |
| 3.7.1 构建重组质粒并转化大肠杆菌 |
| 3.7.2 测序结果分析 |
| 3.7.3 重组质粒转化农杆菌 |
| 3.8 农杆菌介导的北柴胡遗传转化 |
| 3.8.1 潮霉素临界值的筛选 |
| 3.8.2 共培养时间和侵染液浓度对转化效率的影响 |
| 3.8.3 不同柴胡器官对转化效率的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 关于北柴胡再生体系优化的探索 |
| 4.2 关于Bc IAA13 基因的分析、克隆及超表达载体的建立 |
| 4.3 关于农杆菌介导的北柴胡遗传转化体系 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（5）罂粟科植物毛黄堇分子鉴定、活性成分及肝保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 紫堇属化学成分研究 |
| 2 紫堇属药理作用研究 |
| 3 紫堇属植物资源研究 |
| 4 本草基因组学研究及应用 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 6 参考文献 |
| 第二章 毛黄堇及同属物种DNA条形码鉴定研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料、试剂、仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 引物通用性及序列特征 |
| 4.2 遗传距离及Barcoding gap |
| 4.3 不同片段及其组合鉴定效率比较 |
| 4.4 不同分析方法的鉴定效率比较 |
| 4.5 叶绿体和核基因片段的聚类分析 |
| 5 小结与讨论 |
| 6 参考文献 |
| 第三章 毛黄堇及同属物种叶绿体基因组鉴定研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料、试剂、仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 叶绿体基因组基本信息 |
| 4.2 叶绿体基因组注释 |
| 4.3 叶绿体基因组重复序列 |
| 4.4 叶绿体基因组比较 |
| 4.5 毛黄堇及近缘种鉴定及亲缘关系分析 |
| 5 小结与讨论 |
| 6 参考文献 |
| 第四章 毛黄堇核基因组测序及生物碱合成途径预测 |
| 1 引言 |
| 2 材料、试剂、仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 基因组测序数据统计及survey分析 |
| 4.2 基因组组装 |
| 4.3 基因组重复序列 |
| 4.4 基因预测及非编码RNA |
| 4.5 基因家族扩张与收缩 |
| 4.6 ~(13)C稳定同位素示踪毛黄堇生物碱代谢通路 |
| 4.7 毛黄堇生物碱合成途径预测 |
| 4.8 毛黄堇生物碱合成上游途径关键酶基因筛选 |
| 4.9 毛黄堇生物碱合成关键酶基因差异表达 |
| 5 小结与讨论 |
| 6 参考文献 |
| 第五章 毛黄堇总生物碱化学成分分离鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料、试剂、仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 毛黄堇总生物碱化学成分鉴定 |
| 4.2 毛黄堇药材化学成分分析方法学验证 |
| 4.3 不同部位毛黄堇药材化学成分比较 |
| 4.4 野生和栽培毛黄堇化学成分比较 |
| 4.5 不同采收期毛黄堇化学成分比较 |
| 5 小结与讨论 |
| 6 参考文献 |
| 第六章 毛黄堇肝保护作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料、试剂、仪器 |
| 3 试验方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 毛黄堇水提物对酒精所致急性肝损伤的保护作用 |
| 4.2 毛黄堇水提物对四氯化碳所致急性肝损伤的保护作用 |
| 5 小结与讨论 |
| 6 参考文献 |
| 第七章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人筒历 |
（6）药用植物分子遗传学研究（论文提纲范文）
| 1 药用植物分子遗传学体系构成基础 |
| 1.1 药用植物遗传资源 |
| 1.2 药用植物结构基因组 |
| 1.3 药用植物基因功能研究 |
| 1.4 药用植物分子遗传学研究方法 |
| 1.4.1 药用植物基因组研究方法 |
| 1.4.2 药用植物基因功能研究方法 |
| 1.4.3 药用植物遗传修饰技术 |
| 1.4.4 药用植物分子育种技术 |
| 2 药用植物分子遗传研究应用 |
| 2.1 药用植物分子标记与鉴定 |
| 2.2 药用植物分子育种 |
| 2.3 药用植物天然产物的生物合成 |
| 3 药用植物分子遗传学研究发展方向 |
| 3.1 推进千种草药基因组计划实施,夯实药用植物分子遗传学基础 |
| 3.2 建立以药用模式物种及突变体库为主体的药用植物基因功能研究平台 |
| 3.3 建立药用植物生物合成基因元件库及专一底盘细胞,通过发酵工程实现活性成分生物合成的大规模生产 |
| 3.4 基于分子育种技术培育(双高)药用植物新品种 |
（7）药用植物生产体系构建——生物技术的应用（论文提纲范文）
| 1 药用植物离体再生 |
| 2 次生代谢产物生产体系 |
| 2.1 植物细胞培养技术 |
| 2.2 不定根培养技术 |
| 2.3 内生真菌生物转化技术 |
| 2.4 组培材料的稳定性检测 |
| 3 存在问题 |
| 4 前景展望 |
（8）药用植物对干旱胁迫响应的研究进展（论文提纲范文）
| 1. 干旱胁迫对药用植物生长发育的影响 |
| 2. 干旱胁迫对药用植物生理生化特性的影响 |
| 3. 药用植物对干旱胁迫的应答机制 |
| 4. 应用基因工程技术提高药用植物抗旱性 |
| 5. 结语 |
（9）短小蛇根草WRKY转录因子的克隆与功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 植物次生代谢产物 |
| 1.2 喜树碱概述 |
| 1.2.1 喜树碱的发现 |
| 1.2.2 喜树碱特征 |
| 1.2.3 喜树碱的作用机理 |
| 1.2.4 喜树碱类的化合物的应用 |
| 1.2.5 喜树碱的药源解决途径 |
| 1.2.6 喜树碱代谢工程 |
| 1.3 短小蛇根草 |
| 1.4 喜树碱生物合成途径 |
| 1.5 植物转录因子 |
| 1.5.1 植物转录因子概述 |
| 1.5.2 WRKY转录因子 |
| 1.6 本课题的研究目的和研究意义 |
| 第2章 短小蛇根草WRKY转录因子研究策略 |
| 2.1 短小蛇根草 WRKY 转录因子差异表达基因的发现 |
| 2.2 短小蛇根草 WRKY 转录因子功能研究思路以及研究目标 |
| 第3章 短小蛇根草 WRKY 转录因子家族基因的生物信息学分析与功能初步评价 |
| 3.1 短小蛇根草 WRKY 转录因子家族基因的获得及结构特征分析 |
| 3.1.1 实验方法 |
| 3.1.2 结果与分析 |
| 3.1.3 讨论 |
| 第4章 喜树碱合成关键 OpWRKY 转录因子的筛选 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 非转基因单系毛状根摇瓶培养生长周期喜树碱含量变化 |
| 4.1.2 非转基因单系毛状根摇瓶培养生长周期中基因表达量变化 |
| 4.1.3“转录因子-化合物”关联性分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 非转基因单系毛状根摇瓶培养生长周期喜树碱含量变化 |
| 4.2.3 短小蛇根草非转基因毛状根中相关基因对摇瓶培养生长的表达响应 |
| 4.2.4“转录因子-化合物”关联性分析 |
| 第5章 材料与方法 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌种与质粒 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.1.4 培养基及常用试剂的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 短小蛇根草的无菌苗快繁 |
| 5.2.2 短小蛇根草OpWRKY1,OpWRKY2和OpWRKY3基因的克隆 |
| 5.2.3 生物信息学分析 |
| 5.2.4 OpWRKY1,OpWRKY2和OpWRKY3的亚细胞定位 |
| 5.2.5 植物表达载体的构建 |
| 5.2.6 农杆菌C58C1介导的植物表达载体遗传转化 |
| 5.2.7 短小蛇根草转基因毛状根的阳性鉴定 |
| 5.2.8 短小蛇根草转基因毛状根阳性克隆的q RT-PCR分析 |
| 5.2.9 短小蛇根草转基因毛状根的有效成分检测 |
| 5.2.10 转基因毛状根中喜树碱的共聚焦显微镜观察分析 |
| 5.2.11 酵母单杂实验 |
| 第6章 结果与讨论 |
| 6.1 OpWRKYs基因的克隆 |
| 6.2 OpWRKYs生物信息学分析 |
| 6.2.1 进化树分析 |
| 6.2.2 多重序列比对 |
| 6.2.3 蛋白质高级结构预测 |
| 6.2.4 组织表达谱分析 |
| 6.2.5 诱导表达谱分析 |
| 6.3 OpWRKYs的亚细胞定位分析 |
| 6.3.1 载体pMON530::OpWRKY1的构建 |
| 6.3.2 载体pMON530::OpWRKY2的构建 |
| 6.3.3 载体pMON530::OpWRKY3的构建 |
| 6.3.4 瞬时转化烟草 |
| 6.4 植物过表达载体构建 |
| 6.4.1 载体pCAMBIA2300~+::OpWRKY1的构建 |
| 6.4.2 载体pCAMBIA2300~+::OpWRKY2的构建 |
| 6.4.3 载体pCAMBIA2300~+::OpWRKY3的构建 |
| 6.5 植物抑制表达SRDX载体构建 |
| 6.5.1 载体pCAMBIA2300~+::OpWRKY1的构建 |
| 6.5.2 载体pCAMBIA2300~+::OpWRKY2的构建 |
| 6.5.3 载体pCAMBIA2300~+::OpWRKY3的构建 |
| 6.6 农杆菌 C58C1 介导的短小蛇根草外植体的遗传转化 |
| 6.7 转基因短小蛇根草毛状根的 PCR 鉴定 |
| 6.7.1 空菌以及pCAMBIA2300+空载体转基因短小蛇根草毛状根鉴定 |
| 6.7.2 pCAMBIA2300~+::OpWRKYs转基因短小蛇根草毛状根的鉴定 |
| 6.7.3 pCAMBIA2300~+::OpWRKYs-SRDX转基因短小蛇根草毛状根鉴定 |
| 6.8 转基因毛状根的q RT-PCR分析及HPLC含量测定 |
| 6.8.1 OpWRKY1转基因毛状根的qRT-PCR分析 |
| 6.8.2 OpWRKY1转基因毛状根的HPLC含量测定 |
| 6.8.3 OpWRKY2转基因毛状根的qRT-PCR分析 |
| 6.8.4 OpWRKY2转基因毛状根的HPLC含量测定 |
| 6.8.5 OpWRKY3转基因毛状根的qRT-PCR分析 |
| 6.8.6 OpWRKY3转基因毛状根的HPLC含量测定 |
| 6.9 转基因毛状根中喜树碱的共聚焦显微镜观察分析 |
| 6.9.1 喜树碱在毛状根中的位置分布 |
| 6.9.2 喜树碱在毛状根中的空间分布 |
| 6.9.3 转基因毛状根根尖中喜树碱的分布 |
| 6.10 酵母单杂 |
| 6.10.1 OpCPR启动子分析 |
| 6.10.2 酵母单杂载体的构建 |
| 6.10.3 酵母单杂结果分析 |
| 6.11 讨论 |
| 第7章 总结与展望 |
| 7.1 研究总结 |
| 7.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的研究成果 |
| 已发表的文章 |
| 已获得的其他成果 |
| 致谢 |
（10）明党参悬浮培养体系的建立及香豆素含量的调控研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 我国药用植物组织培养生产次生代谢产物的研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 药用植物组织培养国内外应用现状 |
| 1.3 药用植物组织培养传统技术与新技术的对比 |
| 1.4 药用植物组织培养生产次生代谢产物的研究 |
| 1.5 提高组织培养生产次生代谢产物的有效方法 |
| 2 明党参的研究进展 |
| 2.1 明党参生物学特性研究及其濒危原因 |
| 2.2 明党参化学成分研究 |
| 2.3 明党参药理作用研究 |
| 2.4 明党参组织培养及研究现状 |
| 3 课题研究内容及技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 明党参细胞悬浮培养体系的建立 |
| 第一节 明党参愈伤组织的诱导及筛选 |
| 1.1 材料、试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 明党参细胞悬浮培养体系的建立及优化 |
| 2.1 材料、试剂与仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 明党参细胞二步法悬浮培养探索 |
| 1 材料、试剂与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 一步法培养 |
| 2.2 二步法培养 |
| 2.3 生物量的测定 |
| 2.4 总香豆素含量测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同培养方法对悬浮细胞生长及总香豆素类成分的影响 |
| 3.2 HPLC法测定两种培养方法下明党参悬浮细胞中香豆素的含量 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 抗褐化剂对明党参悬浮细胞生长和次生代谢产物含量的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 维生素C(AsA)对明党参悬浮细胞生长和次生代谢产物影响 |
| 2.2 活性炭(AC)对明党参悬浮细胞生长和次生代谢产物影响 |
| 2.3 酸水解酪蛋白(AHC)对明党参悬浮细胞生长和次生代谢产物影响 |
| 2.4 硫代硫酸钠(Na_2S_2O_3)对明党参悬浮细胞生长和次生代谢产物影响 |
| 2.5 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对明党参悬浮细胞生长和次生代谢产物影响 |
| 2.6 维生素C加入水杨酸诱导的明党参悬浮细胞液后佛手柑内酯含量的变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 不同诱导子对明党参悬浮细胞中呋喃香豆素积累的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 愈伤组织的诱导 |
| 1.2 细胞悬浮培养的建立 |
| 2 方法 |
| 2.1 诱导试验方案 |
| 2.2 明党参悬浮细胞生物量的测定 |
| 2.3 明党参悬浮细胞呋喃香豆素含量测定 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 五种诱导子对明党参悬浮细胞内外香豆素含量及种类的影响 |
| 3.2 诱导子诱导时间长短的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 主要创新点 |
| 不足与展望 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附图 |
四、基因工程技术提高药用植物次生物质产量研究进展（论文参考文献）
- [1]黄耆苯丙氨酸解氨酶基因（AmPAL）参与植物抗逆性的功能解析[D]. 范丽娟. 东北林业大学, 2020
- [2]基因工程在药用植物研究中的应用及其发展前景[J]. 刘锦红,李思敏,王紫莹,生书晶. 热带农业科学, 2020(05)
- [3]广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究[D]. 陈秀珍. 广州中医药大学, 2020(06)
- [4]农杆菌介导的北柴胡遗传转化体系的建立[D]. 李玉婵. 西南科技大学, 2020(08)
- [5]罂粟科植物毛黄堇分子鉴定、活性成分及肝保护作用研究[D]. 任风鸣. 北京协和医学院, 2019
- [6]药用植物分子遗传学研究[J]. 陈士林,吴问广,王彩霞,向丽,师玉华,张栋,胡灏禹. 中国中药杂志, 2019(12)
- [7]药用植物生产体系构建——生物技术的应用[J]. 张洋,洑香香,尚旭岚. 中药材, 2018(01)
- [8]药用植物对干旱胁迫响应的研究进展[J]. 任子豪. 当代化工研究, 2017(08)
- [9]短小蛇根草WRKY转录因子的克隆与功能初步研究[D]. 武超. 上海师范大学, 2016(09)
- [10]明党参悬浮培养体系的建立及香豆素含量的调控研究[D]. 周萍. 南京中医药大学, 2016(04)