大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因系统的体外抑瘤研究

一、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因系统的体外杀瘤研究（论文文献综述）

李玉淼^[1]（2016）在《嘌呤核苷磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及其应用研究》文中研究表明嘌呤核苷磷酸化酶（Purine Nucleoside Phosphorylase,简称PNPase）是一类可逆磷酸化酶,其催化嘌呤核苷分解形成核糖-1-磷酸和相应的嘌呤碱基。针对成品啤酒中嘌呤含量高,长期饮用易引发痛风等问题,论文以pET-28a（+）为载体,构建了PNPase重组质粒,并在大肠杆菌中表达。分离纯化重组蛋白PNPase,将其应用到糖化醪液中,可将麦汁中嘌呤核苷分解为游离嘌呤碱基,后者在发酵阶段被酵母吸收利用,成品啤酒中嘌呤含量显着降低,为低嘌呤啤酒的生产提供可行性策略。主要研究结果如下:构建pET-28a（+）-PNPase重组质粒并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,对重组蛋白表达条件进行了优化,确定最优条件:37℃培养细胞至OD600=0.6后,加入IPTG至终浓度为0.05 mmol×L-1,30℃继续诱导表达7 h,经HPLC检测重组菌酶活力为184.46 U·mL-1。利用His TrapTM excel亲和层析柱纯化His-Tag融合蛋白,并对纯化产物进行SDS-PAGE电泳和酶活检测,确定其纯度。对PNPase进行酶学性质研究,发现该酶的最适作用pH为7.0,在p H 6.0-10.0条件下有很好的pH稳定性;最适反应温度为60℃,在30-50℃均能保持较高的酶活力;该酶对腺苷、鸟苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷和脱氧肌苷等表现出不同的水解能力,其中以肌苷为底物时所测酶活最高;EDTA、K+可以使酶活稍微升高1.1倍,Na+、Ca2+、Mg2+、尿素对酶活力几乎没有影响,Zn2+、Fe2+、Mn2+抑制酶的活力,而1 mmol×L-1 Ag+强烈抑制酶的活力;该酶遵循米氏方程,其动力学参数Vmax=58.82 mol·L-1·min-1,Km=2.71 mmol·L-1。将PNPase应用到啤酒的酿造过程中,发现PNPase可有效分解麦汁中结合态的嘌呤核苷,进而提高麦汁中游离嘌呤碱基含量,促使发酵阶段酵母吸收利用更多的游离嘌呤碱基,最终降低啤酒中嘌呤含量。其中以全大麦麦芽为原料酿造啤酒,发酵液中总嘌呤碱基含量可由86.23 mg×L-1降低至64.89 mg×L-1;以40%的玉米糖浆为辅料酿造啤酒,发酵液中总嘌呤碱基含量可由53.12 mg×L-1降低至37.77 mg×L-1;以30%的小麦麦芽、40%的玉米糖浆作为辅料酿造啤酒,发酵液中总嘌呤碱基含量可由39.59 mg×L-1降低至31.00mg×L-1;发酵液中总嘌呤碱基含量大约降低25%左右。

陶国庆^[2]（2011）在《重组大肠杆菌产嘌呤核苷磷酸化酶发酵条件的优化》文中指出本文研究了培养基组成对大肠杆菌BL2 1发酵生产PNPase的影响,重点研究了复合培养基及合成培养基的影响。在复合培养基中,C/N比3：1为菌体生长及蛋白表达的最优碳氮比,K离子对菌体生长、目的蛋白含量及发酵液酶活有明显促进作用,有机氮无机氮比例的变化对菌体生长无明显影响,但对蛋白表达影响较大,呈现出有机氮越少,蛋白表达越差的趋势。在合成培养基中,微量元素是实现高密度培养必不可少的,菌体生长及蛋白表达的最优碳氮比为10：1。在复合培养基和合成培养基的对比中发现,两种培养基最优碳氮比条件下菌体生长相近,但蛋白表达相差较大。考虑到有机氮无机氮的差异造成的,故以有机氮无机氮为着眼点进行了对比,发现无机氮是高密度培养中不可或缺的,无无机氮时大肠杆菌无法高密度生长,随之目的蛋白的高表达也不能达到。有了无机氮菌体生长不受影响,但必须有合适量的有机氮（有机氮无机氮比合理）才能实现重组蛋白的高表达。为深入研究营养（特别是氮源）供给与菌体生长蛋白表达的关系,建立了分析细胞内关键代谢物α-酮戊二酸的方法。在此基础上监控了不同培养基条件下α-酮戊二酸含量的变化,结果表明α-酮戊二酸可以通过自身的变化（积累或维持一定水平）来反映营养条件（相对缺乏或丰富）的变化,也验证了John A and Jeremy Aα-酮戊二酸是氮源调节信号分子的结论。

饶泽昌,李文林,石小玉^[3]（2008）在《大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶的特性及其在基因治疗中的应用》文中研究指明

饶泽昌^[4]（2008）在《PNP基因克隆及其表达载体的构建与鉴定》文中研究指明目的:研究PNP基因的克隆、真核表达载体的构建与鉴定,为肿瘤的基因治疗与基因工程的应用提供实验和理论依据。方法:①大肠埃希氏杆菌K12 PNP基因的PCR扩增;②重组质粒pMSCV-PNP的构建;③用氯化钙法制备感受态大肠杆菌（XL1-Blue）;④转化感受态菌:用携带目的基因的重组质粒pMSCV-PNP转化感受态XL1-Blue大肠杆菌,同时设立阳性对照组和阴性对照组。转移适量转化菌于平皿培养,筛选氨苄青霉素抗性转化菌落;⑤提取质粒和酶切重组质粒:提取重组质粒pMSCV-PNP,限制性内切酶EcoRⅠ和BglⅡ双酶切重组质粒,电泳鉴定;⑥PCR鉴定、测序鉴定重组质粒pMSCV-PNP;⑦提取质粒和酶切质粒:限制性内切酶BspHⅠ、BglⅡ、AflⅡ分别酶切pVSV-G,pGAG-POL,pMSCV,电泳鉴定质粒。结果:①PNP基因PCR扩增出特异条带;②重组质粒pMSCV-PNP电泳结果与预期一致;③重组质粒pMSCV-PNP转化结果:实验组平皿上可见近百个菌落,阳性对照组有数百个菌落生长,而阴性对照组则未见菌落生长;④阳性克隆质粒pMSCV-PNP PCR鉴定、酶切鉴定,电泳条带与预期一致;测序结果正常;⑤克隆质粒pVSV-G,pGAG-POL,pMSCV酶切鉴定与预期一致。结论:①从大肠埃希氏杆菌K12中克隆到PNP基因;②构建了表达载体pMSCV-PNP;③抽提了三种载体质粒pMSCV、pVSV-G、pGAG-POL。

周旭^[5]（2003）在《丁酰胆碱脂酶基因纳米粒的研究》文中研究指明在药剂学中，使用高分子材料，用适当的方法制备的微粒制剂已经得到广泛而深入的研究，并取得一定的成果。纳米粒递送系统是指具有超微小尺度的、携带具有生物活性成分的粒子，粒径范围在1—1000nm。当前，纳米粒作为非病毒性基因递送载体成为研究热点。一般认为纳米粒子包裹基因后，能够增强基因在体外的稳定性，防止体内核酸酶的降解，对基因起到保护作用，增加基因进入目的细胞的数量，提高基因转染效率，使其更有效地表达出所需要的目的蛋白。 本研究选择了绿色荧光蛋白质粒基因（pIRES2＿EGFP）和丁酰胆碱酯酶质粒基因（pRcCMV-BchE）作为模型基因药物，在前面研究的基础上，用绿色荧光蛋白质粒基因（pIRES2＿EGFP）重点考察表面修饰、转染效率，用丁酰胆碱酯酶质粒基因（pRcCMV-BchE）优化纳米粒制备工艺、考察纳米粒理化性质、并对其体外转染效率以及体内递送进行了初步研究。 采用复凝聚法制备了丁酰胆碱脂酶基因-壳聚糖纳米粒，考察了壳聚糖浓度、质粒基因浓度、硫酸钠浓度、体系的pH值和涡旋混合时间等对纳米粒粒径的影响，结果表明：一定条件下，随着壳聚糖浓度的增大，平均粒径减小；随着基因浓度的增大，平均粒径增大；硫酸钠浓度、体系的pH值以及混合时间的变化，军事医学科学院硕士学位论文丁酸胆碱脂酶基因纳米粒的研究中文摘要对粒径大小影响不显着，壳聚糖与基因之间的相互作用，对粒径具有非常显着的影响。经过筛选优化的纳米粒制备条件是:壳聚糖浓度300μg/mL、质粒基因浓度100μg/mL、硫酸钠浓度5mM，pH值5.5，涡旋混合时间30秒。 在优化的纳米粒制备工艺条件下，研究了丁酞胆碱脂酶基因纳米粒的理化性质。用透射电镜和扫描电镜观察了粒子形态和大小，用纳米粒度分析仪（PCS）测量粒径、多分散度、Zeta电位等指标，用荧光光谱法测定纳米粒的载药量和包封率。所制得的纳米粒总平均径、强度平均径、体积平均径、数目平均径、多分散度和ZETA电位，结果分别为218.1nm、238nm、421.9nm、69.7nm、0.291、+15.gmV。粒径分布测定图和多分散度数值表明:壳聚糖纳米粒的粒径分布范围较窄，绝大多数粒子粒径在loonln以下。Zeta电位测定结果表明，基因壳聚糖纳米粒表面带有正电荷，电荷之间的排斥作用对粒子稳定性有利。丁酞胆碱脂酶基因纳米粒的载药量和包封率分别为38.52%、98.64%。包封率大于98%，说明质粒基因几乎全部成粒子，纳米粒混悬液中剩余基因很少，证明制备工艺具有可行性。载药量可达38%以上，证明壳聚糖包裹基因的能力比较强。 为了提高纳米粒体系的稳定性和靶向性，本文对基因壳聚糖纳米粒进行PEG化修饰并在其表面连接肝实质细胞靶向配基---一半乳糖基牛血清白蛋白。用透射电镜对PEG化纳米粒和进一步连接半乳糖基牛血清白蛋白的纳米粒进行观察，结果表明:经冷冻干燥后，表面修饰纳米粒在水中的重分散性良好，纳米粒形态没有显着变化。纳米粒PEG化和连接糖蛋白，对粒径大小没有显着影响。 利足体外基因转染评价了壳聚糖纳米粒的基因递送能力，选择人胚胎肾细胞和肝癌细胞进行体外转染实验，系统考察了细胞培养时间、基因递送剂量、表面修饰情况以及不同基因类型等对转染效果的影响。结果表明:细胞培养三天左右、递送基因剂量在4pg左右转染效果较好，纳米粒表面连接PEG对转染有利，当在PEG化纳米粒表面继续连接蛋白配基时，转染效果反而会有所下降。 本文对pRc/C Mv一BChE一壳聚糖纳米粒的小鼠体内基因递送进行了初步研究。实验结果表明:在10阳/209小鼠体重的给药剂量下，随着时间增加，小鼠血浆内的BChE含量从给药后第3天开始逐渐增加，在第6天BChE含量可以达到原来水平的两倍，此后进入稳态。随着给药剂量增加，小鼠血浆内BChE含量逐渐增 2军事医学科学院硕士学位论文丁酸胆碱脂酶基因纳米粒的研究中文摘要加，在10林g/209给药剂量下，小鼠血浆内BChE含量达到较高水平，此后在考察时间段内，进入相对的稳态。以上实验结果表明壳聚糖纳米粒的体内基因递送研究取得一定成功，证明壳聚糖纳米粒用于体内基因递送具有技术可行性。 本文的研究结果表明，纳米粒基因递送载体值得深入研究，利用药剂学中纳米控释制剂的研究成果，加快纳米粒作为非病毒性基因递送载体研究的步伐。

杜芝燕,黄伟,李峰生,谢庆军,陆应麟,崔光华^[6]（2003）在《新型纳米转染试剂转染PNP自杀基因体外杀伤实验》文中认为将壳聚糖纳米粒包裹的报告基因pEGFP-N1质粒转染至HEK293细胞,并在HEK293细胞中成功表达荧光蛋白的基础上,进一步将本室自行构建的PNP基因的真核高效表达载体质粒pcDNA3-PNP转染至HEK293细胞。转染72h后,对转染的HEK293细胞给予前体药6-MPDR至终浓度40μg/ml,一天后,采用MTT比色法测定药物对细胞增值的影响,并进行统计学处理。实验结果表明采用壳聚糖纳米粒转染试剂转染并给予前体药6-MPDR的实验组活细胞数,与用壳聚糖转染但不给前体药6-MPDR的对照组活细胞数相比,有显着差异（P<0.05）,说明新筛选出的壳聚糖纳米粒转染试剂可以将PNP自杀基因递送至靶细胞中,并在细胞中进行表达,从而使PNP/6-MPDR自杀基因系统发挥杀伤细胞的作用。分别采用相同工作浓度的脂质体与壳聚糖纳米粒转染试剂转染相同浓度的基因质粒,壳聚糖纳米粒对靶细胞生长数量影响很小,说明的壳聚糖纳米粒细胞毒性大大低于阳离子脂质体的细胞毒性。

谢庆军,陆应麟,李庶心,刘爽,王涛,王志清^[7]（2000）在《大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因系统的体外杀瘤研究》文中指出

二、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因系统的体外杀瘤研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因系统的体外杀瘤研究（论文提纲范文）

（1）嘌呤核苷磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及其应用研究（论文提纲范文）

（2）重组大肠杆菌产嘌呤核苷磷酸化酶发酵条件的优化（论文提纲范文）

（4）PNP基因克隆及其表达载体的构建与鉴定（论文提纲范文）

（5）丁酰胆碱脂酶基因纳米粒的研究（论文提纲范文）

（6）新型纳米转染试剂转染PNP自杀基因体外杀伤实验（论文提纲范文）

四、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因系统的体外杀瘤研究（论文参考文献）

• [1]嘌呤核苷磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及其应用研究[D]. 李玉淼. 江南大学, 2016(02)
• [2]重组大肠杆菌产嘌呤核苷磷酸化酶发酵条件的优化[D]. 陶国庆. 华东理工大学, 2011(07)
• [3]大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶的特性及其在基因治疗中的应用[J]. 饶泽昌,李文林,石小玉. 实用癌症杂志, 2008(05)
• [4]PNP基因克隆及其表达载体的构建与鉴定[D]. 饶泽昌. 南昌大学, 2008(01)
• [5]丁酰胆碱脂酶基因纳米粒的研究[D]. 周旭. 中国人民解放军军事医学科学院, 2003(01)
• [6]新型纳米转染试剂转染PNP自杀基因体外杀伤实验[J]. 杜芝燕,黄伟,李峰生,谢庆军,陆应麟,崔光华. 生物技术通讯, 2003(01)
• [7]大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因系统的体外杀瘤研究[J]. 谢庆军,陆应麟,李庶心,刘爽,王涛,王志清. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2000(04)

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