一、免疫基因治疗肿瘤的应用研究（论文文献综述）
鲁愿[1]（2021）在《卡介苗与焦亡溶瘤策略的构建及其在宠物肿瘤治疗中的应用初探》文中研究表明肿瘤是威胁宠物生命健康的最主要病因之一,而宠物自发肿瘤与人类肿瘤发生、发展的机制相对保守,所以参照人类肿瘤的研究方法,开发宠物肿瘤治疗方法是非常必要的。以PD-1/PD-L1阻断为代表的免疫检查点阻断疗法已在临床肿瘤治疗中取得了喜人的进展,但也存在患者响应率低的应用局限。这可能与肿瘤所处的免疫抑制微环境有关。所以靶向肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,简称TME）,可能是突破免疫检查点阻断疗法应用局限的一种有效手段。卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,简称BCG）和细胞焦亡,均已被证明可在肿瘤部位激起强烈的抗肿瘤免疫反应,是很好的重塑TME免疫状态的工具。目前BCG仅在临床非肌层浸润性膀胱癌的治疗中得到应用,而在其他肿瘤类型,例如三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,简称TNBC）中的应用和研究相对较少。此外,诱发焦亡的gasdermin蛋白家族N端结构域(the N-terminal gasdermin domain,GSDMNT)具有很强的细胞毒性,常规的基因递送载体包装策略无法避免包装时GSDMNT的表达,因此很难获得携带GSDMNT的重组载体,所以目前缺乏将GSDMNT安全有效递送至肿瘤细胞的方法。本研究以BCG及焦亡为手段,构建了利用BCG或焦亡激活TME内抗肿瘤免疫的溶瘤策略,研究了BCG或焦亡对动物肿瘤模型的溶瘤机制,探索了PD-L1阻断剂与BCG或焦亡联合使用对TNBC小鼠模型的疗效,并进一步在宠物肿瘤临床治疗应用中进行了初步探索。本研究主要取得了以下结果:1利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫1)在TNBC小鼠模型中证实,单倍剂量BCG治疗能够上调肿瘤中趋化因子相关基因和抗肿瘤效应基因的表达,下调免疫抑制相关基因的表达,增加肿瘤浸润淋巴细胞数量,重塑TME免疫抑制状态;三倍剂量BCG治疗可以显着抑制肿瘤生长,但也存在小鼠体重下降的不良反应。2)利用Bulk RNA-seq和q RT-PCR证实,单倍剂量BCG治疗可以上调TNBC小鼠模型肿瘤中免疫筛查位点PD-1和PD-L1的表达;在此基础上开发了单倍剂量BCG联合PD-L1抑制剂的溶瘤方案,并在TNBC小鼠模型中证实该联合治疗方案具有显着溶瘤效果且没有体重下降的不良反应。2构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫1)筛选出一个在昆虫Sf9细胞中不表达的哺乳动物启动子m CBA,证实了以m CBA启动子驱动GSDMNT可以避免昆虫Sf9细胞的焦亡;由此开发了利用哺乳动物启动子m CBA和杆状病毒/昆虫Sf9细胞包装表达焦亡蛋白重组腺相关病毒载体的策略,并获得了可以介导肿瘤细胞焦亡的溶瘤腺相关病毒载体P1（Oncolytic AAV P1,简称o AAV-P1）。2)证实将GSDMNT基因序列翻转并在两侧加上两对反向lox P序列可避免HEK293T细胞的焦亡,加入Cre重组酶则又可恢复GSDMNT的表达从而介导焦亡,由此开发了利用Cre重组酶和三质粒/HEK 293T细胞包装表达焦亡蛋白重组腺相关病毒载体的策略,并获得了可以介导肿瘤细胞焦亡的溶瘤腺相关病毒载体P2（Oncolytic AAV P2,简称o AAV-P2）。3)在肿瘤细胞及多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,简称GBM）大鼠模型中证实了o AAV-P2相对o AAV-P1有更好、更快的溶瘤效果,并证实此种差异与昆虫Sf9细胞包装的AAV感染性弱及m CBA启动子活性相对弱均有关。4)在GBM大鼠模型中证实,o AAV-P2介导的焦亡可以暂时性打开血脑屏障,破坏GBM的TME,招募淋巴细胞杀伤肿瘤,延长GBM大鼠模型的生存期;在TNBC小鼠模型中证实,o AAV-P2治疗可以上调肿瘤中趋化因子相关基因和抗肿瘤效应基因的表达,下调免疫抑制相关基因的表达,增加肿瘤内淋巴细胞浸润,改变TME免疫抑制状态。5)通过对TNBC小鼠模型肿瘤Bulk RNA-seq分析,发现o AAV-P2治疗可以增加肿瘤内免疫筛查位点PD-L1和PD-L2的表达,由此开发了o AAV-P2联合PD-L1阻断剂的溶瘤方案,并在TNBC小鼠模型进行了验证,证实了该联合方案具有很好的肿瘤治疗效果,可显着抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长。本研究以TME为靶点,开发了BCG联合PD-L1阻断剂的溶瘤方案,该方案可有效治疗TNBC,为宠物临床发病率较高的乳腺癌提供了有效治疗方案;同时本研究构建了两种表达焦亡蛋白重组腺相关病毒的包装策略,获得了具有溶瘤效果的o AAV-P1和o AAV-P2;且这两种包装策略具有良好的扩展性和安全性,也可用于其他毒性蛋白的重组腺相关病毒载体的包装,为靶向TME的宠物肿瘤治疗提供了更多的备选工具。
郭琼[2]（2021）在《CEACAM6启动子介导PE38KDEL毒素基因治疗人舌鳞状细胞癌的研究》文中研究说明人舌鳞状细胞癌（hOTSCC）是口腔癌中发病率和死亡率最高的一种,具有复发风险高、预后差的特点。临床上治疗hOTSCC的手段仍主要以手术、放疗和化疗为主。然而这些治疗手段往往缺乏靶向性,具有较高的毒副作用,对患者的生存质量造成了严重的影响。因此,开发hOTSCC的基因靶向药物成为当下的研究热点。肿瘤的毒素基因治疗通过肿瘤特异性启动子来调控毒素的表达,使毒素基因只在肿瘤细胞中表达,而在正常组织和细胞中不表达,因而使治疗具有更高的安全性和治疗效率。近年来,肿瘤毒素基因治疗受到了越来越多的研究者的青睐。然而,截止目前,关于hOTSCC毒素基因治疗的报道仍然很少。CEACAM6是细胞表面的一种粘附因子,在多种肿瘤中都过表达,糖基化的CEACAM6可以作为早期口腔鳞状细胞癌患者复发的肿瘤标志物。因此,本文拟用CEACAM6启动子来调控假单胞菌外毒素A的表达,构建hOTSCC毒素基因治疗质粒并探索其对hOTSCC的治疗效果。首先,我们通过qRT-PCR检测了CEACAM6在不同细胞中的表达情况。结果表明,CEACAM6在hOTSCC细胞中显着过表达,而在正常细胞中的表达量则很低,表现出了较强的OTSCC表达特异性。然后,利用基因重组技术构建了p CEACAM6-PE38KDEL毒素表达质粒和p CEACAM6-Basic萤火虫荧光素酶表达质粒,并利用萤火虫荧光素酶活性检测的办法测定CEACAM6启动子的表达活性及表达特异性。结果表明,CEACAM6启动子在体外条件下可以特异性地调控萤火虫荧光素酶的表达,同样表现出了较强的OTSCC表达特异性。因为PE38KDEL毒素可以导致真核细胞翻译延长因子（e EF2）失活,我们利用共转染的方法检测毒素质粒对hOTSCC细胞蛋白合成的特异性抑制作用,并分别利用细胞增殖抑制实验、流式细胞术、TUNEL、Western Blotting、Transwell和伤口愈合试验在体外检测毒素质粒对OTSCC细胞的靶向抑制和杀伤作用。和预期的一样,p CEACAM6-PE38KDEL毒素表达质粒可以特异性抑制OTSCC细胞TCA8113的蛋白合成,对其增殖、侵袭和迁移也具有明显的抑制作用,同时还能诱导其发生凋亡和细胞周期阻滞。相反,对正常细胞以及CEACAM6表达阴性的细胞则影响很小。在裸鼠移植瘤模型中,p CEACAM6-PE38KDEL同样表现出了良好的体内治疗效果,对肿瘤的形成以及生长均具有显着的抑制作用。与此同时,通过H&E、免疫组化检测我们发现,该毒素表达质粒不会对机体的正常组织及器官造成明显的损伤,具有较高的生物安全性。本文的研究结果表明,CEACAM6启动子介导的PE38KDEL毒素基因治疗药物能够有效地抑制和杀伤hOTSCC细胞,具有很高的靶向性和安全性,有望成为未来在临床上进行hOTSCC基因靶向治疗的候选药物。
顾军权[3]（2021）在《抑制VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA干预骨肉瘤的研究》文中指出目的研究同时靶向VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA对骨肉瘤细胞株（MG-63和Saos-2）中VEGF和Survivin基因的抑制效应,和对细胞迁移,血管生成,增殖以及凋亡的影响。本研究通过探讨一链双靶siRNA的作用机制,拓展了目前的核酸干扰技术,为一链多靶核酸干扰技术的开发奠定了基础。本研究将为多靶siRNA核酸干扰相关药物的研发提供理论依据和技术支持。方法1.合成两个单靶siRNA（siRNA-Survivin和siRNA-VEGF）,在此基础上,设计并合成同时靶向VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA（siRNA-VEGF-&Survivin）。2.将靶向VEGF和Survivin两个单靶siRNA和同时靶向VEGF和Survivin一链双靶siRNA转染到骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）中,通过荧光显微镜检测转染效率。3.运用QRT-PCR和Western Blot技术检测各转染组细胞（MG-63和Saos-2）中VEGF和Survivin基因m RNA及蛋白的表达。4.免疫荧光法和免疫组化检测各转染组细胞（MG-63和Saos-2）中VEGF和Survivin蛋白的定位及表达,并检测其基因沉默效果。5.MTT法检测各转染组MG-63和Saos-2细胞的增殖水平,流式细胞术检测MG-63和Saos-2细胞凋亡水平。6.划痕试验测定各转染组MG-63和Saos-2的细胞迁移,血管形成试验检测各转染组MG-63和Saos-2细胞的血管形成。结果1..成功构建符合设计要求的靶向VEGF和Survivin的单靶siRNA和一链双靶siRNA序列。2.各组siRNA均成功地转染到MG-63和Saos-2细胞中,转染率达到80%。3.Western Blot、QRT-PCR、免疫荧光和免疫组化法分析显示:单靶siRNA组和一链双靶siRNA组中VEGF和Survivin m RNA和蛋白的表达水平均低于对照组和未转染组,差异有统计学意义（均P<0.05）。一链双靶siRNA组在m RNA和蛋白的表达水平上与各单靶siRNA组相似,差异无统计学意义（P>0.05）。4.双靶siRNA组具有较强的抑制肿瘤细胞增殖和血管形成,并阻抑肿瘤细胞迁移而促进肿瘤细胞凋亡,效果均明显优于单靶siRNA组。结论1.沉默VEGF和Survivin基因的单靶siRNA-VEGF、siRNA-Survivin和一链双靶siRNA均能有效下调MG-63和Saos-2细胞中VEGF和Survivin基因的表达。2.体外实验证实,单靶siRNA和一链双靶siRNA对骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）的迁移和血管生成具有明显的抑制作用。3.体外实验证实,单靶siRNA和一链双靶siRNA均能抑制骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）增殖,促进细胞凋亡。4.一链双靶siRNA能显着抑制骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）的增殖和血管形成,并阻抑骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）迁移而促进其凋亡,效果均明显优于单靶siRNA组。5.VEGF和Survivin基因无相关性,一链双靶siRNA较单靶siRNA发挥了双倍的抑制骨肉瘤细胞增殖和促进凋亡的效果。
刘晓亭[4]（2020）在《新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究》文中提出目前医学水平和诊断技术得到了快速的发展,但癌症的发病率和死亡率仍然处在较高水平,是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。癌症的早期诊断和精准治疗是决定癌症能否得到成功治愈的关键因素。近年来,肿瘤标志物的不断发现为癌症早期诊断提供了保障,细胞内肿瘤标志物种类较多,表达水平也有所差异,对于一些低表达丰度的肿瘤标志物需要建立更加灵敏的分析方法。另一方面,化学治疗作为癌症治疗的经典方法之一,但化疗通常会受到化疗药物低溶解性、强的毒副作用及耐药性等问题的制约,因此,需要开发具有特定功能的纳米载体进行化疗药物的递送。本论文致力于新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送方面的应用研究。通过对目前已报道的核酸纳米载体进行总结,发现随着核酸纳米载体研究的深入,仍然存在一些不足和挑战:（1）现有的核酸纳米载体多为细胞质递送化疗药物,耐药细胞中细胞膜上过表达的外排转运体会将细胞质中的药物重新泵出细胞,降低细胞内的药物浓度,限制化疗效果,因此,如何构建药物作用位点靶向的核酸纳米载体对于提高药物的作用效果具有重要意义;（2）在应对化疗过程中出现的药物耐受性的问题上,常用的策略是利用纳米载体避开外排转运体介导的药物外排,而直接抑制外排转运体的表达是一种更根本的策略来应对药物耐受性;（3）细胞内许多肿瘤标志物的表达丰度偏低,目前多数具有细胞成像和药物递送双重功能的核酸纳米载体输出方式为1:1式,极大的限制了检测的灵敏度和药物释放,构建具有信号放大特性的核酸纳米载体来实现活细胞内肿瘤标志物的灵敏检测及药物释放是一个关键问题。基于以上问题和挑战,设计了三种新型的核酸纳米载体用于活细胞内肿瘤标志物的成像及药物递送。本文主要分为以下五章内容:第一章为绪论部分,主要分析了癌症诊断和治疗上所面临的严峻挑战,介绍了用于核酸纳米载体设计的经典核酸结构单元、金纳米颗粒,概述了核酸纳米载体在癌症诊断与治疗中的研究进展,并以此为基础总结了目前核酸纳米载体在细胞成像和药物递送上存在的问题。第二章,构建了一种内源性刺激响应核靶向的纳米载体（AuNP-mRS-DSs）用于活细胞内MRP1 mRNA的成像和药物递送。纳米载体由三部分组成:（ⅰ）金纳米颗粒（AuNP）,用于装载DNA和淬灭荧光;（ⅱ）mRNA识别序列（mRS）通过金-硫键连接到AuNP表面,用于MRP1 mRNA的特异性识别;（ⅲ）可拆卸的亚单位（DS）,由Cy5标记的DNA连接链和核仁素识别基序（含AS1411适体）杂交而成,并通过DNA连接链连接到mRS上,用于装载阿霉素（Dox）、结合核仁素及荧光信号的输出。首先,纳米载体的核仁素识别基序靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,然后整个纳米载体在核仁素介导的内化作用下进入细胞。随后,mRS特异性识别过表达的MRP1 mRNA,从而释放束缚的DS,被AuNP淬灭的Cy5荧光恢复。最后,利用核仁素从细胞质到细胞核穿梭的作用,DS靶向细胞核递送Dox。细胞内荧光成像可以实现耐药细胞和非耐药细胞的区分。此外,通过荧光成像可以观察到耐药细胞中释放的可拆卸亚单位的分布。与游离阿霉素（IC50>8.00 μM）相比,将 Dox 装载到 AuNP-mRS-DSs 后对 MCF-7/ADR细胞的IC50更低为2.20 μM,这表明利用核酸纳米载体载药对耐药的乳腺癌细胞具有极好的抑制效果。该纳米载体在癌症化疗敏感性预测和耐药性的规避上具有重要意义。第三章,构建了多功能分子信标（MBs）修饰的金纳米颗粒作为纳米载体（MBs-AuNP）,用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像。MBs-AuNP由两部分构成:（ⅰ）三种特殊设计的分子信标修饰到AuNP表面,用于结合耐药相关的mRNAs,装载Dox并输出荧光信号;（ⅱ）AuNP,用于装载MBs,介导MBs进入细胞并淬灭荧光。被细胞摄取后,MBs-AuNP与三种不同的耐药相关 mRNA（MDR1 mRNA、MRP1 mRNA 和 BCRP mRNA）杂交,通过抑制mRNAs的翻译过程来减少外排蛋白的表达,同时,被AuNP淬灭的荧光团远离金纳米粒,荧光恢复,实现mRNAs的原位成像。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹结果表明,经MBs-AuNP处理后耐药肿瘤细胞内耐药相关mRNA和外排蛋白的表达均有所下降。与游离Dox相比,Dox-MBs-AuNP对HepG2/ADR（IC50:0.35 vs 1.06μM）和 MCF-7/ADR（IC50:2.78 vs>5μM）具有更好的细胞毒性。通过荧光成像分析可直接观察细胞内杂交事件并实现耐药和非耐药肿瘤细胞的区分。该纳米载体能够通过基因沉默来下调多种外排蛋白的表达,实现对沉默事件的原位监测,提供了一种从基因水平应对药物耐受性的策略。第四章,构建了一种端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体（tsDNA-AuNP）用于细胞内端粒酶的活性分析及药物递送。该纳米载体由三部分构成:（ⅰ）AuNP,用于装载DNA并淬灭荧光;（ⅱ）行走链,由端粒酶引物和含DNAzyme序列的发卡结构杂交而成,用于结合端粒酶及切割底物发卡;（ⅲ）含有DNAzyme切割位点的底物发卡,用于装载阿霉素并输出荧光信号。该纳米载体内化入胞后,端粒酶引物在端粒酶的作用下发生延伸,打开含DNAzyme序列的发卡结构,释放被封闭的DNAzyme序列,然后行走链沿着三维的轨道运动,在外加Mn2+的作用下切割含DNAzyme切割位点的底物发卡,输出荧光信号并释放阿霉素,随后进行下一轮的切割反应。该方法能够实现低至10个HeLa细胞中端粒酶活性的检测,通过荧光成像的方法能够实现肿瘤细胞和正常细胞的区分,此外,该核酸纳米载体也能够用于端粒酶抑制剂的筛选。第五章为结论部分,主要总结了本论文的创新点及前景展望。
胡箫[5]（2020）在《溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒对小鼠结肠癌模型免疫状态及肿瘤微环境影响的研究》文中认为背景作为肿瘤生物治疗的前沿领域,近年来,溶瘤病毒疗法显示出了巨大的应用潜力,并为肿瘤的免疫治疗提供了新的方向。溶瘤病毒疗法可通过直接于瘤内注射溶瘤病毒来触发局部和全身的免疫反应,以达到溶解肿瘤细胞,然后释放肿瘤相关抗原,随后激活肿瘤特异性效应T细胞的目的。多种溶瘤病毒在临床前和临床试验中显示出了良好的安全性、靶向性以及令人兴奋的治疗效果。一种基于Ⅰ型单纯疱疹病毒的溶瘤病毒talimogene laherparepvec（T-VEC）已经完成了Ⅲ期临床试验,并已获得美国食品和药物管理局（FDA）的批准上市,用于治疗初次手术后复发的不可切除的黑色素瘤。了解溶瘤病毒治疗肿瘤所引起的机体免疫系统的改变及其对肿瘤微环境的影响,有利于为今后更好地应用溶瘤病毒进行免疫治疗提供有利依据。因此,本研究中我们应用一种基于Ⅱ型单纯疱疹病毒的溶瘤病毒oHSV2,探讨其在免疫完全和免疫缺陷荷瘤小鼠（小鼠结直肠癌CT26细胞系）模型中的直接溶瘤作用及其引起的抗肿瘤免疫应答。目的本研究的主要目的是明确oHSV2在荷瘤小鼠（小鼠结直肠癌CT26细胞系）模型中的直接溶瘤作用及其引起的抗肿瘤免疫应答。通过建立免疫完全和免疫缺陷小鼠双侧荷瘤模型,检测脾脏中淋巴细胞的表型和对肿瘤细胞的杀伤作用,以及分析双侧肿瘤微环境中的病理学特征和免疫基因的表达情况,为溶瘤病毒oHSV2激发机体特异性抗肿瘤免疫应答,改变肿瘤微环境的免疫状态提供依据。方法（1）应用CCK-8增殖实验检测oHSV2对小鼠结肠癌CT26细胞系的体外溶瘤活性。（2）通过皮下接种方式建立BALB/c小鼠单侧和双侧荷瘤（小鼠结直肠癌CT26细胞系）模型,探讨oHSV2的体内治疗作用及其引起的抗肿瘤免疫应答。（3）采用二次打击和免疫学杀伤实验,探讨oHSV2引起的特异性免疫应答。（4）通过皮下接种方式建立免疫缺陷小鼠双侧荷瘤（小鼠结直肠癌CT26细胞系）模型,探讨先天性免疫应答在oHSV2治疗肿瘤过程中发挥的作用。（5）应用流式细胞术检测各治疗组小鼠脾脏淋巴细胞的表型状态,同时分析双侧肿瘤病理学特征及免疫相关基因表达谱特征,探讨oHSV2治疗后机体整体免疫状态和局部肿瘤微环境的变化情况。结果（1）溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒oHSV2对小鼠结肠癌CT26细胞系具有显着的溶瘤作用,其效果呈时间和剂量依赖性。（2）在单侧和双侧小鼠结肠癌荷瘤模型上观察oHSV2的体内抗肿瘤作用。oHSV2治疗能有效抑制单侧和双侧肿瘤生长,延长小鼠存活时间,并且无明显副作用。（3）oHSV2治疗能够有效阻止相同肿瘤再次接种后成瘤。对于双侧荷瘤模型,单个病灶内的oHSV2治疗可同时有效抑制双侧肿瘤的生长。（4）NK细胞引起的非特异性免疫反应,即对靶细胞（被病毒感染的肿瘤细胞）的非特异性识别杀伤作用,在oHSV2治疗肿瘤的过程中同样起到了一定的抑制肿瘤生长的作用。（5）oHSV2的应用能够有效降低外周免疫中免疫抑制性细胞（如Tregs和MDSCs）的水平,有利于打破免疫耐受;同时提高了外周免疫中正向免疫细胞（如NK细胞、DCs、CD8+T细胞的）的水平,有利于加强非特异性和特异性抗肿瘤免疫反应;紧随特异性免疫应答后机体形成了免疫记忆,有利于有效防止肿瘤的转移和复发。（6）oHSV2治疗改变了肿瘤微环境的免疫状态。这种作用并非只局限于接受治疗的局部组织,而是同时会对其他部位的同种肿瘤微环境引起相似的改变。结论溶瘤病毒oHSV2发挥的第一重抗肿瘤作用即相对直接的使肿瘤细胞发生裂解而死亡,在第一重作用的基础上,肿瘤相关抗原（TAAs）伴随着肿瘤细胞的裂解而被释放,从而展现oHSV2治疗带来的第二重作用,即引起机体先天性免疫应答和特异性免疫应答。紧随特异性免疫应答后机体形成了免疫记忆,可有效防止肿瘤的转移和复发。溶瘤病毒oHSV2的应用可以重构小鼠脾脏和肿瘤微环境的免疫状态（包括未经病毒直接治疗的肿瘤）,提示oHSV2的局部治疗模式可以转变为一种全身性的治疗模式。因此,溶瘤病毒oHSV2具有很好的临床应用潜力。
王清华[6]（2020）在《肺腺癌中两个不同免疫亚型的鉴定》文中认为研究目的:免疫检查点抑制剂（Immune checkpoints blockade,ICB）治疗极大的延长了肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）患者的生存期。但在实际的临床治疗中,仅有很少的一部分病人能够从中受益。当前ICB治疗广泛应用的生物标志物虽然在一定程度上能够预测患者治疗的获益程度,但是较低的回应率驱使我们寻找新的更有效的免疫治疗预测指标。研究方法:我们收集了来自肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和基因表达公共数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）10个队列的2300例肺腺癌样本的全基因组表达数据和临床信息,其中TCGA样本作为训练集,GEO样本作为验证集。2995个免疫相关的基因收集于TCGA泛癌症免疫图谱项目,免疫基因的表达水平与肺腺癌患者预后的关系利用单因素Cox比例风险模型（Cox回归）进行评估。潜在的分子亚型利用非负矩阵分解（Nonnegative matrix factorization,NMF）算法进行鉴定。不同亚型患者ICB免疫治疗的获益程度利用TIDE（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion）算法进行评估。PD-L1表达和TMB在不同亚型的差异利用Wilcoxon秩和检验进行计算。基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）用于计算不同亚型之间信号通路富集的差异。Mut Sig CV算法用于确定肺腺癌患者的显着突变基因（Significantly mutated genes,SMG）。研究结果:1.TCGA训练集中,433个基因的表达与肺腺癌患者的预后存在显着相关性（FDR<0.05）。我们利用433个预后免疫基因对TCGA患者进行NMF聚类分析,发现当聚类个数为2时,模型评估系数能获得最大值,初步确定肺腺癌存在两个潜在的分子亚型。生存分析表明,两个亚型具有显着不同的生存结局（HR:1.99,95%CI:1.43-2.76,Log rank P<0.001）,校正混杂变量的多因素Cox回归模型仍然具有统计学意义（HR:1.80,95%CI:1.28-2.53,P<0.001）。在GEO的9个独立的肺腺癌数据集中,8个数据集所确定的两个亚型也具有显着不同的生存结局,差异具有统计学意义（Log rank P<0.01）,另外一个数据集表现出相同的趋势,但没有达到统计学差异（Log rank P=0.092）。我们将预后较差的肺腺癌亚型命名为‘‘高风险亚型’’,预后较好的命名为‘‘低风险亚型’’。2.TCGA结果表明,相对于低风险亚型,高风险亚型患者具有更低的TIDE分数（Wilcoxon秩和检验,P<0.001）;TIDE分数越低,代表肿瘤细胞免疫逃逸的可能性越低,因此具有更好的免疫微环境;包含临床变量的多因素Logistic回归模型结果仍然具有统计学意义（OR:0.13,95%CI:0.08-0.20,P<0.001）。GEO的9个验证数据集也得到了相似的结果（Wilcoxon秩和检验,所有P<0.05）。3.TCGA队列和包含PD-L1表达数据的7个数据集中,与低风险亚型相比,高风险亚型患者具有显着更高的PD-L1表达水平（Wilcoxon秩和检验,P<0.05）。TCGA队列中,高风险亚型患者具有更高的TMB,差异具有统计学意义（Wilcoxon秩和检验,P<0.001）。我们将临床变量,提取的突变特征和DNA损伤修复基因的突变纳入多因素Logistic回归模型以消除假阳性结果,结果表明高风险亚型患者仍然具有显着更高的TMB（OR:3.99,95%CI:2.19-7.46,P<0.001）。4.GSEA结果表明,细胞周期相关的信号通路能够显着富集到高风险亚型患者（FDR<0.05）,细胞周期各阶段相关检查点基因的表达水平在高风险亚型也显着上调（Wilcoxon秩和检验,所有P<0.001）。5.TCGA队列中,单因素和多因素分析显示,TP53,NAV3,COL11A1,KEAP1和SMARCA4在高风险患者中具有显着更高的突变率（OR>1,P<0.01）。我们利用包含TP53突变信息的3个数据集验证了高风险亚型和TP53高突变率的这一相关性。研究结论:本研究通过对2300例肺腺癌样本的免疫相关基因组学的分析,鉴定了肺腺癌预后不同的高风险和低风险亚型。其中,高风险亚型具有更低的TIDE分数,更高的PD-L1表达水平、TMB和显着激活的细胞周期、TP53突变。肺腺癌高风险亚型接受ICB免疫治疗可能会获得更好的治疗效果。
李胜[7]（2019）在《唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路对骨肉瘤细胞系凋亡的作用》文中研究表明目的:骨肉瘤来源于间叶组织,多发生在骨组织,是一种常见于青少年或儿童的恶性骨肿瘤,男性患者多于女性,它的病程进展快、肺部转移早、预后不良、易复发,甚至死亡。目前骨肉瘤的治疗包括通过手术措施尽量完整切除病灶以及围手术期的抗肿瘤的综合辅助治疗。新辅助化疗作为化疗的首选,其不仅可以增加手术的安全性,而且能够为患者量身定制合适的假体做好准备。但目前化疗的药物品种有限,常伴随明显的全身毒副反应,给患者带来痛苦,寻找更多有效、副作用小的药物以及阐明其作用原理势在必行。唑来膦酸是具有代表性的、副作用小的第三代二膦酸盐,它具有骨代谢调节的特性,在体外能够起到抑制破骨细胞活动的作用,进而导致破骨细胞调亡,所以能够抑制骨破坏活性增加诱发的骨质吸收。另外有研究显示,唑来膦酸还可以抑制或粘滞肿瘤细胞基质释放的多种刺激因子引起的破骨细胞活动增强和骨钙释放,从而减缓骨转移的进展和发生,并可一定程度上的导致骨肉瘤细胞的死亡。PI3K/AKT信号通路是参与多数细胞的分化调节、生长、繁殖的信号转导通路。AKT别称蛋白激酶B在活化后,继续激活它的下游因子（GSK-3β等）,起到调节细胞周期、凋亡的作用。糖原合成激酶3β是关键的糖原合成酶,依赖其底物的磷酸化调节多个重要的细胞信号通路。大量的研究结果表明GSK-3β在骨肉瘤中表达增高,抑制其活性骨肉瘤细胞凋亡发生改变。Wnt信号通路参与骨髓基质干细胞的分化与更新,影响成骨及破骨细胞的生成分化,调节骨骼修复,对骨骼的生长发育、再生、重塑起到关键作用。Wnt信号通路能够引起β-连环蛋白β-Catenin的降解复合体包括Axin、APC、CK1、GSK-3β等,使细胞内β-Catenin积累、游离的β-Catenin进入细胞核,从而调节基因表达。本文旨在研究唑来膦酸对骨肉瘤细胞系的生物学行为的影响;唑来膦酸作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞后PI3K-AKT、Wnt信号通路相关重要蛋白、基因表达影响。研究方法:1、采用MTT法检测骨肉瘤MG-63细胞在分别加入0、25、50、100、200μmol/L唑来膦酸后24、48、72h后细胞活力变化;在50%抑制率药物浓度时间作用后,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞活力变化。2、划痕实验明确骨肉瘤MG-63细胞在分别加入0、25、50、100、200μmol/L唑来膦酸,24、48、72h后细胞侵袭迁移力及凋亡状态;3、透射电镜观察骨肉瘤MG-63细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡情况变化;4、流式细胞仪检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡情况变化;5、蛋白印迹方法Western Blot检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用48h后,随着唑来膦酸作用药物浓度的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达情况;检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸100μmol/L作用24、48、72h后,随着唑来膦酸作用时间的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达情况;检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1的蛋白表达情况。结果:1、MTT结果显示,骨肉瘤MG-63细胞随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,细胞活力抑制率及凋亡程度增加,50%抑制率约为药物100μmol/L作用48h;单纯GSK-3β抑制剂组与对照组比较无明显差异,GSK-3β抑制剂+实验药物组结果能够抑制细胞活力,但与相同条件实验药物组比较具有保护细胞活力的作用。2、划痕实验结果显示,骨肉瘤MG-63细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用24、48、72h后,随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,细胞迁移能力受到抑制,细胞出现明显凋亡变化。3、透射电镜结果显示,骨肉瘤MG-63细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组细胞结构完整;实验药物组及GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡明显,以实验药物组效果显着。4、流式细胞仪检测结果显示,骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组细胞轻度凋亡,实验药物组及GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡程度明显,以实验药物组凋亡率更高。5、蛋白印迹方法Western Blot结果显示骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1蛋白结果表达相当;实验组及GSK-3β抑制剂+实验药物组的β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1蛋白表达下降,以实验组显着;骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用48h后及100μmol/L作用24、48、72h后的结果显示,随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达降低。结论:1、唑来膦酸在体外具有抑制骨肉瘤MG-63细胞生长、促进其凋亡的作用;2、唑来膦酸作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞后,GSK-3β下游的蛋白β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1表达降低;实验组给予GSK-3β抑制剂Li2CO3后,β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1的表达较实验组升高,说明唑来膦酸通过GSK-3β/β-Catenin信号通路影响骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡。3、唑来膦酸可以使P-AKT、PGSK-3β表达下降,进而影响其下游蛋白β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1表达下调,说明唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路影响骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡。
戴薇[8]（2019）在《NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究》文中提出癌症是目前困扰人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的手术切除、放疗、化疗和最新的免疫疗法已被用于癌症治疗,提高了病人的五年存活率,但由于不可避免的毒副反应使得疗效还与病人对于生命健康的期望相差甚远。NF-κB是一种序列特异性DNA结合型转录因子,通过与细胞核内DNA靶点结合,调控靶基因的表达,从而参与炎症反应、免疫应答以及细胞生长、分裂和凋亡等多种生理病理过程。NF-κB在各种癌症中过度活化,是抗肿瘤药物筛选和癌症治疗的优良靶点。由于NF-κB是一把“双刃剑”,传统的NF-κB活性抑制剂因其显着的毒副作用而未能成为临床药物。抑制从来不是解决问题的好办法,应采用因势利导的策略,创制新的肿瘤治疗技术。本研究发展了三种肿瘤基因治疗新技术,并探索了其生物医学研究领域的应用价值,主要研究成果包括以下:1.人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用研究发现,过度活化的NF-κB与肝炎和肝细胞癌（HCC）的发生密切相关,但其完整而精确的分子途径和机制目前还不清楚。本研究使用Ch IP-seq和RNA-seq高通量测序技术,在TNFα诱导的人HCC细胞系Hep G2细胞中共计鉴定出699个NF-κB直接靶基因（direct target gene,DTG）,包括399个激活基因和300个抑制基因。其中,216个基因（包括126个激活基因和90个抑制基因）是目前已经鉴定出的HCC基因标志物。比较TNFα诱导的Hep G2细胞、LPS诱导的THP-1细胞和TNFα诱导的He La细胞中NF-κB靶基因数目,仅有24–46个NF-κB靶基因由两种细胞系共有,表明本研究鉴定出的NF-κB DTG具有HCC细胞特异性。基因功能注释分析表明,Hep G2细胞中的NF-κB DTG主要富集在经典的NF-κB生物学过程,如免疫系统过程、压力反应、刺激反应、防御反应和细胞死亡,并且涉及MAPK、TNF、TGF-β、趋化因子、NF-κB和Toll样受体KEGG信号通路。部分NF-κB DTG也与丙型肝炎和乙型肝炎病毒密切相关。此外,82个NF-κB DTG编码的分泌蛋白是目前临床上已经使用的HCC生物标志物,如CCL2和DKK1。最后,通过Ch IP-q PCR和RT-q PCR实验证实,NFKB1、NFKBIA、CCL2、IL1A、IL1B、PTX3、NUDT7、EFNA5、ID4、GPC6、KLF15、DKK1、OAZ2和IGFBP3这14个基因是TNFα诱导的Hep G2细胞中NF-κB DTG。这些结果为进一步研究NF-κB相关的分子机制和HCC生物标志物诊疗技术的发展提供了有价值的基因信息。2.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究转录因子NF-κB在各种肿瘤细胞/组织中过度活化,已经成为抗肿瘤药物研发和肿瘤治疗的优良靶点。正因如此,过去几十年发展了无数的NF-κB活性抑制剂,然而由于不可避免的毒副反应,没有一例抑制剂成为临床使用的药物。本研究中,利用NF-κB在肿瘤细胞中高度活化的生物学特性,发展了一种肿瘤细胞特异性基因疗法,即NF-κB激活的基因表达（NF-κB-activated gene expression,Nage）载体用于癌症治疗。Nage载体通过将NF-κB诱骗子序列（decoy）与最小启动子序列（minimal promoter）融合构成NF-κB特异性启动子（decoy minimal promoter,DMP）,DMP与肿瘤细胞内高表达的NF-κB结合,从而激活下游效应基因的表达。本研究首先使用Western-blotting方法验证了NF-κB p65蛋白在肿瘤细胞中特异性表达。随后以绿色荧光蛋白Zs Green作为效应基因,证实Nage载体可在肿瘤细胞中特异性表达效应基因,产生绿色荧光,而在正常细胞中不表达效应基因。随后,以CRISPR/Cas9作为效应基因,在靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）的引导下,Nage载体特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,而对正常细胞293T、MRC-5和HL7702不产生影响。最后,将表达Cas9-Tsg RNA的Nage载体包装进腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）中,构建肿瘤基因治疗载体AAV-Nage,通过静脉注射给药途径注入小鼠体内,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究发展的肿瘤细胞特异性基因疗法Nage载体为抗肿瘤药物研发提供了一种新思路。3.端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究癌症是由一系列表观基因突变引起的,以多种复杂形式存在的难以预防和治疗的疾病。端粒酶是真核细胞中负责端粒延长的一种RNA聚合酶。研究发现,端粒酶的活性在大多数正常细胞中被程序性关闭,而在90%的肿瘤细胞中被重新激活,使其成为癌症治疗中的重要靶点。目前,已开发出多种端粒酶活性抑制剂用于治疗癌症,但由于不可避免的毒副反应均已失败告终。本研究中,利用肿瘤细胞中端粒酶的活性发展了一种名为端粒酶激活的基因表达（telomerase-activated gene expression,Tage）系统用于治疗癌症。Tage系统由一段携带端粒酶可识别的3’粘性末端效应基因表达载体、表达d Cas9-VP64人工转录因子的表达载体和靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）组成。以CRISPR/Cas9作为效应基因,Tage系统有效地杀灭多种肿瘤细胞,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,但对正常细胞293T、MRC-5、HL7702和骨髓间充质干细胞（BMSC）不产生影响。更重要的是,酵母同宗接合切换内切酶（homothallic switching endonuclease,HO）切割产生的4碱基3?粘性末端可被细胞中端粒酶识别并延伸,为Tage系统体内应用奠定基础。以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）作为基因载体,实现了Tage系统体内安全有效治疗肿瘤的目的。荷载Tage系统的AAV经静脉注射给药,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长,并且没有观察到明显的毒副反应。4.肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究癌症由不同分化等级和致瘤潜力的肿瘤细胞构成,是一种高度异质性、难以预防和治疗的疾病。癌干细胞或肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多能分化和无限增殖潜能的肿瘤细胞亚群,对维持肿瘤细胞异质性和致瘤性起关键作用。CSC可抵抗常规抗癌药物,并在肿瘤转移和复发中发挥重要作用,使得抗肿瘤药物研发面临巨大挑战。本研究中,使用前期发展的两种肿瘤细胞特异性基因疗法,端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和NF-κB激活的基因表达（Nage）载体24 h内有效地杀灭旺盛分裂的肿瘤细胞,残存细胞具有CSC自我更新增殖特性。q PCR检测发现,涉及上皮/间充质细胞转换、Wnt信号通路、细胞间粘附以及干细胞标志基因VIM、TWIST、p53、p16INK4α、p21、CD24、CD326、DLL4、JAG1、Notch1、MUC1、DACH1、CD133、CD44、ATXN1、BMP7、CXCR4、GATA3、JAK2、KLF4、LIN28a、LIN28b、MYCN、NANOG和SOX2,在残存肿瘤细胞中均高表达,表明Tage系统和Nage载体可在24 h内有效分离得到CSC。研究发现,NF-κB不仅在各种肿瘤细胞中高度活化,在CSC中也显示出高活性,使其有望成为针对CSC的肿瘤治疗靶点。将前期发展的新型NF-κB活性抑制剂,即NF-κB特异性启动子DMP调控的靶向Rel A的mi R533包装进腺相关病毒（AAV）中,构成肿瘤干细胞基因治疗载体AAV-mi R533。AAV-mi R533有效地杀灭Hep G2 CSC,感染病毒20 d后的CSC仍没有再生长增殖迹象。本研究为分离CSC和开发针对CSC的抗肿瘤药物提供了新方法。总之,本研究通过联合运用高通量测序技术、生物信息学技术和传统的分子生物学技术,鉴定出了肝癌细胞中NF-κB的结合靶点和靶基因,发展了三种肿瘤细胞基因治疗新技术—NF-κB激活的基因表达（Nage）载体、端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和肿瘤干细胞基因治疗载体,这些基因技术在肿瘤基因治疗领域具有重要的应用价值。
王丹阳[9]（2018）在《基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术发展及应用研究》文中进行了进一步梳理NF-κB是一种序列特异性DNA结合转录因子。在未激活状态下,NF-κB与其抑制蛋白IκB结合滞留在细胞质中。当细胞受到刺激,如病毒感染、紫外线照射、细胞因子（TNFα等）作用下,通过细胞内的NF-κB信号传导通路,抑制蛋白IκB降解,NF-κB进入细胞核,与核内DNA靶点结合,控制其众多靶基因的表达,从而参与细胞生长、分裂、凋亡、更新、炎症、癌变等生理及病理过程。NF-κB在炎症和癌症中被广泛激活,因此一度成为药物筛选和疾病治疗的重要靶点,如各种NF-κB抑制剂的开发。但由于NF-κB所具有的双刃剑作用,传统NF-κB抑制剂因其显着的副作用而始终未成为临床药物。因此,基于NF-κB的生物医学应用价值的探索需要新的研究策略。本研究发展了三种基于NF-κB的新型基因表达控制技术,并探索了其生物医学应用价值。1.基于NF-κB的高活性真核启动子研制及其应用研究人巨细胞病毒（hCMV）主要早期启动子（MIEP）是目前生命科学基础研究和各类基因工程、基因治疗、基因编辑中广泛使用的活性最高的真核启动子。本研究用指数富集（SELEX）系统筛选获得的高亲和力人工序列替换人MIEP中的天然NF-κB结合位点（κBs）,构建了各种突变型的MIEP（mMIEP）。通过多种转录活性评价系统的检测,本研究成功筛选出了3个转录活性显着高于野生型MIEP的mMIEP。这些mMIEP作为人工启动子可以广泛用于基因工程药物生产及基因治疗领域。此外,本研究为启动子工程提供了一个快速构建和筛选各种活性启动子的新方法,并且制备了一系列具有多种转录活性的mMIEPs,可用于未来合成生物学中目的基因表达水平的灵活控制。本研究将改造的人工启动子应用于hG-CSF蛋白的分泌表达,针对该蛋白的表达研究不仅可以深入的验证启动子表达效率,还为mMIEP启动子在基因工程制药的应用提供了重要依据。2.新型NF-κB活性抑制基因载体的构建及其应用研究已有研究证明,NF-κB通过调控其靶基因,在肿瘤细胞增殖、血管生成和侵袭转移等过程中起重要作用。而且很多研究表明,NF-κB家族蛋白在肿瘤组织细胞中的表达量比在正常组织细胞中有明显的增强。NF-κB已经成为新型药物治疗和研发的重要靶点。因此,研究人员开发了很多不同的NF-κB抑制剂,但由于NF-κB不仅是疾病相关的转录因子,它在细胞的正常生理功能中也发挥重要作用,对其进行过强的抑制会产生严重的副作用,这些抑制剂很难成为商品化的临床药物。为了克服这一局限性,本研究中将经典的NF-κB特异诱骗子（decoy）序列作为一种NF-κB特异性启动子元件,与最小启动子序列融合,构建了一种NF-κB调控启动子（decoy minimal promoter,DMP）。本研究以此启动子构建了一种新型NF-κB活性控制基因载体,该载体能够在DMP启动子的控制下表达靶向于NF-κB RelA的人工miRNA。本研究证实,这种载体可以对细胞内NF-κB活性进行感知和调控。载体在细胞内的表达可以形成一个完美的反馈循环,实现NF-κB的自我调控。将载体转染到细胞内后,NF-κB的活性越高,DMP启动子的转录活性也就越高,amiRNA的表达量也就越高。DMP-amiRNA系统能够适度的抑制NF-κB过度活化细胞（如肿瘤细胞）内的NF-κB活性,引起肿瘤细胞的凋亡,但对正常细胞的不产生显着影响。本研究通过筛选,获得一种效果良好的新型NF-κB活性抑制剂——DMP-amiR533。本研究不仅发展了一种抑制NF-κB活性的新策略,所筛选获得的DMP-amiR533在治疗炎症和癌症等NF-κB过度活化疾病中具有重要应用价值。3.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因表达载体构建及其应用研究近年来,免疫疗法对癌症治疗有很大贡献,但是,肿瘤细胞特异性抗原仍然是目前癌症免疫疗法最关键的限制因素。因此,研究人员正在通过肿瘤测序和生物信息学预测等方法寻找新抗原来开发个性化癌症免疫疗法,但该策略技术复杂性高、成本高、周期长。本研究通过开发肿瘤细胞特异性基因表达技术,构建了一种癌症的新型免疫疗法,该技术使用NF-κB特异性基因表达载体在肿瘤细胞表面表达特定的蛋白质或多肽,这些蛋白质或多肽可以作为人造新抗原起作用,用于区分肿瘤细胞和正常细胞并刺激免疫系统杀死肿瘤细胞。本研究构建并验证了NF-κB活化基因表达（NF-κB-activating gene expression,Nage）载体系统,该载体利用DMP启动子,使载体携带的下游效应基因可以在各种肿瘤细胞表面特异性表达某种蛋白质或多肽,如HBsAg、CRT和SBP。本研究将Nage载体包装在腺相关病毒（AAV）中,作为肿瘤免疫治疗的病毒载体药物,最终结果显示,重组AAV可以显着抑制体内肿瘤的生长,并且在实验鼠上未观察到毒副作用。本研究中提出的新型癌症基因免疫疗法在癌症治疗领域具有重要应用价值。总之,本研究发展了基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术,获得了转录活性显着提高的新型启动子（mMIEP）、新型NF-κB活性控制载体（DMP-amiR533）,以及NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因表达载体（Nage）;这些基于NF-κB的新型基因表达控制技术在生物制药及基因治疗领域具有重要应用价值。
张皓[10]（2016）在《基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究》文中指出肺癌是目前世界上发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,并且呈明显上升趋势。最新的肿瘤流行病学调查显示,男性肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤首位,女性肺癌死亡率也高居所有恶性肿瘤第二位。肺癌已经成为对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一。在本研究中,我们以肺癌为治疗目标,构建以IFN-y为目的基因的基因电路,以PEI-Fe3O4为基因载体,联合西妥昔单抗设计了靶向载基因磁性白蛋白纳米球,将分子靶向治疗、放疗和免疫基因治疗有效联合起来治疗肺癌。主要研究内容如下：第一章肿瘤治疗基因合成和表达研究：基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒的构建与鉴定及其在细胞内的诱导表达[目的]：构建pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG（即p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG）真核表达质粒,并对其进行鉴定。评价其在GLC-82细胞中的诱导表达情况。[方法]：①以pUC57-Simple-cfosp为模板,将cfosp片段酶切下来连接至pYr-adshuttle-8载体得到pYr-ads-8-cfosp典核表达质粒。②以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG片段（IFNG即IFN-y的基因片段）,然后将其亚克隆至pYr-adshuttle-8载体,构建pYr-ads-8-IFNG真核表达质粒。③将pUC57-SimpIe-cfosp及目的载体pYr-ads-8-IFNG双酶切,然后进行连接,构建pYr-ads-8-cfosp-IFNG真核表达质粒。④以pUC57-Simple-5HRE为模板,获得5HRE片段,并将其构建至pUC57-Simple-cfosp载体上,获得pUC57-Simple-5HRE-cfosp。再将其酶切,得到5HRE-cfosp片段,然后将其构建至pYr-adshuttle-8载体上,构建pYr-ads-8-5HRE-cfosp真核表达质粒。同时,将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-8-IFNG载体上,得到PYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG真核表达质粒。⑤以pIRES2-ZsGreenl为模板,PCR扩增IRES片段,并将其构建至pYr-ads-1-iNOS载体上,构建pYr-ads-iNOS-TRESc再以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG基因片段,并将其构建至pYr-ads-iNOS-IRES载体上,得到pYr-ads-iNOS-IFNG。⑥ pUC57-Simple-cfosp为模板,PCR扩增cfosp片段,然后将其构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,得到pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑦将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,获得PYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑧每个步骤后均需挑取阳性克隆,酶切测序鉴定后进行下一步构建,最后大量抽提质粒。⑨将pYr-ads-8-cfosp、pYr-ads-8-IFNG、pYr-ads-8-cfosp-IFNG、 pYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG、pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG、pYr-ads-iNOS-IFNG、 pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG分别转染GLC-82细胞,用2Gy X射线处理后,用QT-PCR分析IFN-y和iNOS（诱导型一氧化氮合酶）基因的表达量。评价基因电路的放大作用及乏氧序列的增强作用。⑩将P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG质粒转染GLC-82细胞后,2Gy剂量的X射线照射后的6h、12h、24h、48h、72h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。分别取转染后的细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射射线照射后24h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。[结果]：①酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒,测序发现插入片段序列无改变,并且开放读码框正确。②用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的相对表达量,结果表明P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG与其他质粒相比,表达量最高,与没有乏氧序列的组（⑥pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG）相比,IFN-y的表达量高了约1.46倍,iNOS的表达量高了2.11倍（p<0.05）。与没有基因电路的组（⑤Yr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG）相比,IFN-y的表达量高了约1.32倍（p<0.05）。③在处理后6h、12h、24h、48h、72h集细胞。用QT-PCR检测IFN-γ和iNOS基因的表达量发现,在诱导6h,IFN-γ和iNOS基因的表达量即开始升高,24h升到最高值。在24h之前,IFN-γ iNOS基因的表达量随时间的延长而增加,之后逐渐减低。④细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射线照射后24h用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的表达量发现,2Gy组的表达量最高,其IFN-y的表达量是1Gy组的4.37倍,4Gy组的1.52倍,8Gy组的2.05倍（p<0.05）。其iNOS的表达量是1Gy组的4.96倍,4Gy组的1.56倍,8Gy组的2.17倍（p<0.05）。[结论1：①成功构建了基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒及中间各用于比较的质粒。并且酶切鉴定、测序鉴定均证实构建成功。②用QT-PCR检测了C-fos启动子的时效性,C-fos启动子在2Gy的X射线诱导24小时后,靶基因的表达量最高。评价了p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG在肺癌细胞内的诱导表达,验证了HRE在缺氧环境中对辐射启动子的增强作用,和基因电路技术的有效性。第二章C225-Fe304/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG（靶向载基因磁性白蛋白纳米球）的制备及靶向性研究[目的]：①制备表征Fe3O4磁性纳米粒,用PEI修饰Fe3O4磁性纳米粒并进行表征,研究PEI-Fe3O4复合物作为基因载体的可行性。②制备载基因磁性白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球。③鉴定靶向载基因磁性白蛋白纳米球的免疫特性（即靶向性）并观察其转染效率。④从体内外水平,探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82细胞的靶向效应。[方法]：①采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒,聚乙烯亚胺（PEI）对其进行表面修饰。②采用透射电镜（transmission electron microscope, TEM）, ZETA SIZER3000激光粒度分析仪,傅立叶红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）对修饰前后纳米粒进行表征。③琼脂糖凝胶电泳检测PEI-Fe3O4结合DNA的情况。利用pEGFP-Cl观察PEI-Fe3O4介导外源基因转染的效率。④采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,用异型双功能交联剂SPDP耦连纳米球和西妥昔单抗（C225）,制备成靶向载基因磁性白蛋白纳米球,运用TEM^ ZETA SIZER3000激光粒度分析仪对其表征,在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的粒径,评价其稳定性。动态测定其体外释放基因速率。用硫氰酸盐分光光度法测其含Fe量。⑤用靶向载基因磁性白蛋白纳米球转染GLC-82细胞,观察其转染效率。⑥运用玻片凝集实验、免疫荧光染色实验鉴定纳米球的免疫特性。⑦采用普鲁士蓝染色、细胞免疫荧光实验及细胞MRI实验观察靶向载基因磁性白蛋白纳米球与人肺癌细胞体外特异性结合的能力。⑧建立裸鼠肺癌移植瘤动物模型,待肿瘤直径达0.5cm左右用于实验,对裸鼠进行MRI。将裸鼠分成C225靶向组、非C225靶向组和C225抑制组。分别经尾静脉注射靶向载基因磁性白蛋白纳米球、非靶向载基因磁性白蛋白纳米球和靶向载基因磁性白蛋白纳米球+C225。在注射前及注射后2h、8h、24h、72h分别进行7.0 Tesla超高场强实验动物MRI系统成像,观察不同时间点肿瘤的信号变化,成像序列包括SE-TIWI、SE-T2WI、GRE-T2*WI。量化分析肿瘤组织信号改变的程度、范围、随时间的改变。测量感兴趣区（肿瘤、肌肉组织）T2WI及T2*WI信号强度,计算信号变化率。最后用SPSS 18.0统计软件进行统计、分析。病理组织学检查：包括常规HE染色、普鲁士蓝染色。[结果]：①制备的Fe3O4和PEI-Fe3O4磁性纳米粒表征：TEM检测显示磁性纳米粒电子密度高、大小较一致,并且修饰前后形态大小差别不大；FTIR结果显示了修饰后纳米粒的特征峰值,证明了PEI的成功吸附；激光粒度分析仪电位分析显示在pH为7的中性环境,Fe3O4纳米粒的zeta电位值为0±0.5mV,而PEI修饰后纳米粒子的电位值为36.3±0.6mV。②琼脂糖凝胶电泳检测到PEI-Fe3O4与DNA结合情况良好；PEI-Fe3O4可将外源基因转染至GLC-82细胞并高效表达。③自制的空载白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在靶向载基因磁性白蛋白纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。ZETA SIZER3000激光粒度分析仪显示载基因磁性白蛋白纳米球的水合粒径为189.5±2.4nm；靶向载基因磁性纳米球的水和粒径约为211.9±3.1nm。在pH为7的中性环境中,载基因磁性白蛋白纳米球的zeta电位值是-37.9±0.4 mV,而耦联了C225的靶向载基因磁性白蛋白纳米球的电位值为-40.2±0.7 mV。在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的纳米球粒径差别不大,稳定性良好。④体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料15小时释放基因为96.45%,曲线平缓；硫氰酸盐分光光度法测含Fe量平均在2.2 mg/ml;转染实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能够有效转染GLC-82细胞,且转染效率高于非靶向载基因磁性白蛋白纳米球。⑤靶向载基因磁性白蛋白纳米球玻片凝集实验与对照组相比,靶向载基因磁性白蛋白纳米球组与抗血清孵育后观察到明显地凝集现象；免疫荧光染色显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球表面发出明亮绿色荧光,而对照组未观察到荧光。⑥普鲁士蓝染色结果显示在靶向组与GLC-82细胞孵育后,细胞内有大量明显蓝染的铁颗粒存在,而非靶向组细胞内少见；细胞免疫荧光染色显示靶向组细胞的表面有绿色荧光,而非靶向组未观察到绿色荧光；细胞MRI实验结果显示靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度不同程度的降低,而非靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度无明显降低。⑦在体MRI成像结果显示,C225靶向组注射后肿瘤组织不同时间点的T2WI、 T2*WI强度及信号变化率均有明显下降,具有统计学差异（p<0.05）。而非C225靶向组和C225抑制组在注射后8h和24h两个时间点的信号亦有轻度下降,但下降幅度较C225靶向组小,且持续时间较靶向组短。不同时间点的T2弛豫时间,从24h时间点开始,C225靶向组与非靶向组和C225抑制组比较具有明显差异,结果有统计学意义（p<0.05）。⑧常规HE染色结果表明所建立的裸鼠荷肺癌皮下移植瘤动物模型符合小鼠肺癌的形态结构。普鲁士蓝染色结果显示：C225靶向组肿瘤组织内见较多的蓝染的颗粒,代表Fe颗粒多；而非C225靶向组和C225抑制组内少见蓝染的Fe颗粒存在。[结论]：①应用化学共沉淀法已成功制备了Fe304磁性纳米粒且PEI成功地修饰于Fe304磁性纳米粒。②修饰后的PEI-Fe3O4磁性纳米粒可以作为基因的载体。③成功制备了白蛋白纳米球、载基因磁性白蛋白纳米球,成功耦连了西妥昔单抗与载基因磁性白蛋白纳米球。④靶向载基因磁性白蛋白纳米球具有缓释作用,并且能高效转染人肺癌细胞GLC-82。⑤细胞实验和体内磁共振实验都说明靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82具有良好的靶向效应。第三章基于基因和分子靶向治疗技术的靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的体内外实验研究[目的]：①体外水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗人肺癌的作用。②通过动物实验,从体内水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对肺癌的治疗作用。[方法]：①体外采用CCK8及流式细胞技术测定靶向载基因磁性白蛋白纳米球体外治疗肺癌的效果。并用透射电镜观察细胞超微结构的变化。②建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将靶向载基因磁性白蛋白纳米球经尾静脉注射入裸鼠,经辐射3次,6周后处死裸鼠。计算肿瘤体积抑制率和质量抑制率,制作肿瘤组织标本,进行常规病理学检查。③通过血清生化检查和血常规检测及各内脏器官组织病理学观察初步评价靶向辐射基因联合治疗的安全性。[结果]：①CCK8实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能明显抑制人肺癌细胞GLC-82的增殖,FCM检测显示其能诱导GLC-82细胞的凋亡,且其效果较其他组显着。透射电镜下可观察到各组细胞均有不同程度的凋亡,细胞内可见磁性材料沉积。②靶向辐射基因联合治疗组的肿瘤质量抑制率和肿瘤体积抑制率分别为82.54%和85.72%,明显高于单抗治疗组（36.51%、34.33%）、辐射放疗组（42.06%、40.89%）、辐射基因联合治疗组（64.29%、65.64%）和靶向辐射联合治疗组（70.63%、72.57%）（p<0.05）。③各治疗组肿瘤有不同程度坏死,部分坏死灶可见炎性细胞浸润。其中靶向辐射基因联合治疗组坏死程度最严重。可见大片坏死灶,坏死区域呈红染,肿瘤细胞崩解,胞核消失,部分细胞核固缩。其它治疗组也均有不同程度的坏死,程度较靶向辐射基因联合治疗组轻,但也可见肿瘤细胞的密度下降,细胞排列松散,胞浆呈红染。阴性对照组与各治疗组的心肝脾肺肾等内脏组织均没有发现明显的病理学变化。④建模前和治疗结束后各组裸鼠血细胞计数,各实验组与阴性对照组及建模前之间均无统计学差异（p>0.05）。提示建模和各治疗对骨髓造血系统无明显抑制作用。[结论]：①靶向辐射基因联合治疗能显着抑制培养人肺癌细胞GLC-82的增殖,诱导细胞凋亡。②分子靶向治疗、放疗和基因治疗三者联合治疗肺癌具有明显的协同作用,能有效抑制肺癌的生长,效果优于单一治疗也优于两两联合治疗。第四章靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的分子机制研究[目的]：从分子水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制。[方法]：①采用免疫组织化学方法检测治疗后各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax、 survivin、VEGF、EGFR、PCNA、p53、Ki67蛋白的表达。②采用western blot检测各治疗组中Bcl-2、Ki67、survivin、caspase-3与caspase-8的表达量,使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。从分子水平上探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的分子机制。[结果]：①单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bax蛋白均有升高,但靶向辐射基因联合治疗组上升最明显。而单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bcl-2、Ki67、p53、PCNA和survivin蛋白均有下降,其中靶向辐射基因联合治疗组下降得最明显。② Wesrern blot的结果显示,各治疗组与阴性对照组相比Bcl-2、Ki67、survivin均有下调,而caspase-3与caspase-8的表达上调。其中以靶向辐射基因联合治疗组最为显着。[结论]：靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制可能与下调PCNA、Ki67蛋白表达而抑制肿瘤增殖；抑制Bcl-2、p53、survivin蛋白表达,上调Bax蛋白表达从而诱导肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤新生血管的形成,抑制EGFR表达有关。
二、免疫基因治疗肿瘤的应用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、免疫基因治疗肿瘤的应用研究（论文提纲范文）
（1）卡介苗与焦亡溶瘤策略的构建及其在宠物肿瘤治疗中的应用初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 宠物肿瘤 |
| 1.2 肿瘤免疫疗法 |
| 1.3 免疫筛查阻断疗法 |
| 1.3.1 免疫筛查位点阻断疗法的机遇与挑战 |
| 1.4 肿瘤免疫疗法新靶点——肿瘤微环境 |
| 1.4.1 肿瘤微环境概述 |
| 1.4.2 “加热”肿瘤微环境的方法 |
| 1.5 卡介苗 |
| 1.5.1 卡介苗概述 |
| 1.5.2 卡介苗的非特异性效应及应用 |
| 1.5.3 卡介苗在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 1.6 焦亡 |
| 1.6.1 焦亡概述 |
| 1.6.2 焦亡的分子机制 |
| 1.6.3 焦亡在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.7 重组腺相关病毒载体 |
| 1.7.1 重组腺相关病毒载体概述 |
| 1.7.2 重组腺相关病毒载体的包装及纯化 |
| 1.7.3 重组腺相关病毒载体在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.7.4 携带细胞毒性基因重组腺相关病毒载体的包装策略 |
| 1.8 三阴性乳腺癌 |
| 1.9 多形性胶质母细胞瘤 |
| 第二章 目的及意义 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞系、病毒和实验动物 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 流式抗体及药物 |
| 3.1.4 工具酶及主要试剂 |
| 3.1.5 细胞培养及转染产品 |
| 3.1.6 主要的培养基、抗生素、缓冲液及其配制 |
| 3.1.7 实验设备 |
| 3.1.8 相关软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 感受态细胞的制备 |
| 3.2.2 质粒构建 |
| 3.2.3 细胞及BCG培养 |
| 3.2.4 4T1-luc及 C6-luc细胞系的构建 |
| 3.2.5 三阴性乳腺癌小鼠模型构建 |
| 3.2.6 BCG治疗对三阴性乳腺癌小鼠模型TME的影响 |
| 3.2.7 BCG治疗三阴性乳腺癌小鼠模型 |
| 3.2.8 BCG治疗对三阴性乳腺癌小鼠模型肿瘤转录组的影响 |
| 3.2.9 单倍剂量卡介苗和抗PD-L1 联合治疗TNBC小鼠模型 |
| 3.2.10 三质粒包装系统包装r AAV |
| 3.2.11 杆状病毒包装系统包装r AAV |
| 3.2.12 r AAV纯化及滴度测定 |
| 3.2.13 哺乳动物启动子的筛选 |
| 3.2.14 利用杆状病毒包装系统包装表达GSDMD~(NT)的oAAV-P1 |
| 3.2.15 利用三质粒包装系统包装表达GSDMD~(NT)的oAAV-P2 |
| 3.2.16 oAAV-P1和oAAV-P2 细胞实验 |
| 3.2.17 oAAV-P1和oAAV-P2 治疗GBM大鼠模型 |
| 3.2.18 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型 |
| 3.2.19 oAAV-P2 联合抗PD-L1 治疗TNBC小鼠模型 |
| 3.2.20 oAAV-P2 治疗TNBC裸鼠模型 |
| 3.2.21 rAAV瘤内注射安全性实验 |
| 3.2.22 表达GSDM~(NT)蛋白oAAV系统通用性验证 |
| 3.2.23 利用诱导型启动子包装表达GSDMD~(NT)蛋白的rAAV |
| 3.2.24 oAAV-P2 在临床宠物肿瘤治疗中的应用 |
| 第四章 利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫 |
| 4.1 卡介苗治疗增加了TNBC小鼠模型TME中浸润淋巴细胞数量 |
| 4.2 卡介苗治疗抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长 |
| 4.3 卡介苗治疗上调了TNBC小鼠模型肿瘤内PD-L1 的表达 |
| 4.4 单倍剂量卡介苗联合PD-L1 阻滞剂可有效抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫 |
| 5.1 利用哺乳动物启动子包装rAAV-GSDM~(NT) |
| 5.1.1 哺乳动物启动子m CBA的鉴定 |
| 5.1.2 哺乳动物启动子m CBA的分析 |
| 5.1.3 oAAV-P1 的包装 |
| 5.2 利用四环素诱导型启动子包装rAAV-GSDM~(NT) |
| 5.3 利用Cre/lox重组酶系统包装r AAV-GSDM~(NT) (oAAV-P2) |
| 5.4 oAAV-P1和oAAV-P2 可以使肿瘤细胞焦亡 |
| 5.5 oAAV-P1和oAAV-P2 诱导细胞焦亡的效率不同 |
| 5.6 oAAV-P1 治疗原位多形性胶质母细胞瘤大鼠模型 |
| 5.7 oAAV-P2 治疗原位多形性胶质母细胞瘤大鼠模型 |
| 5.7.1 oAAV-P2在GBM大鼠模型中有很好的疗效 |
| 5.7.2 oAAV-P2在GBM大鼠模型中可以暂时性打开血脑屏障 |
| 5.7.3 oAAV-P2 治疗双侧接种瘤的GBM大鼠模型 |
| 5.8 oAAV-P2 治疗原位三阴性乳腺癌小鼠模型 |
| 5.9 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型肿瘤浸润淋巴细胞单细胞转录组分析 |
| 5.10 oAAV-P2 治疗TNBC裸鼠模型 |
| 5.11 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型肿瘤转录组分析 |
| 5.12 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型肿瘤浸润淋巴细胞流式分析 |
| 5.13 oAAV-P2 联合PD-L1 阻断治疗TNBC小鼠模型 |
| 5.14 rAAV瘤内注射的安全性评价 |
| 5.15 表达GSDM~(NT)蛋白oAAV系统通用性验证 |
| 5.16 oAAV-P2 在临床宠物肿瘤治疗中的初步应用 |
| 第六章 讨论 |
| 6.1 利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫 |
| 6.2 构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫 |
| 6.3 宠物肿瘤治疗前瞻 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）CEACAM6启动子介导PE38KDEL毒素基因治疗人舌鳞状细胞癌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人舌鳞状细胞癌概述 |
| 1.2 人舌鳞状细胞癌的治疗现状 |
| 1.2.1 手术治疗 |
| 1.2.2 放射治疗 |
| 1.2.3 化疗 |
| 1.2.4 分子靶向治疗 |
| 1.3 肿瘤基因治疗概述 |
| 1.3.1 抑癌基因的癌症治疗 |
| 1.3.2 RNA干扰和沉默 |
| 1.3.3 抗肿瘤血管生成以及抗表皮生长因子受体的基因治疗 |
| 1.3.4 免疫基因疗法 |
| 1.3.5 溶瘤疗法 |
| 1.3.6 基因编辑法 |
| 1.3.7 自杀基因疗法 |
| 1.4 假单胞菌外毒素概述 |
| 1.4.1 假单胞菌外毒素的结构及其致毒机理 |
| 1.4.2 假单胞菌外毒素在肿瘤毒素治疗中的应用 |
| 1.5 癌胚抗原相关细胞粘附因子6 概述 |
| 1.5.1 CEACAM6 的结构 |
| 1.5.2 CEACAM6 与肿瘤的转移的关系 |
| 1.5.3 CEACAM6 与肿瘤的凋亡及分化的关系 |
| 1.5.4 CEACAM6 与肿瘤抗药性的关系 |
| 1.5.5 CEACAM6 与肿瘤免疫的关系 |
| 1.6 本论文立题依据和研究内容 |
| 第二章 CEACAM6 启动子调控的PE38KDEL毒素表达质粒的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要试剂及材料 |
| 2.2.2 所用质粒的结构及特征图谱 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 RNA提取 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR |
| 2.3.5 TCA8113 细胞基因组的提取 |
| 2.3.6 CEACAM6 启动子及PE38KDEL片段的扩增 |
| 2.3.7 DNA的回收 |
| 2.3.8 DNA双酶切 |
| 2.3.9 目的基因与质粒载体的连接 |
| 2.3.10 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.11 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.3.12 质粒提取 |
| 2.3.13 质粒的鉴定 |
| 2.3.14 细胞转染 |
| 2.3.15 荧光素酶测定 |
| 2.3.16 BCA定量 |
| 2.3.17 数据统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同细胞中CEACAM6 基因的表达 |
| 2.4.2 质粒的构建 |
| 2.4.3 质粒的双酶切鉴定 |
| 2.4.4 质粒的测序鉴定 |
| 2.4.5 CEACAM6 启动子在不同细胞中的表达活性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 CEACAM6 启动子调控的PE38KDEL毒素表达质粒的体外抗肿瘤活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 材料及试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 荧光素酶合成抑制试验 |
| 3.3.2 细胞增殖抑制试验 |
| 3.3.3 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡试验 |
| 3.3.4 TUNEL细胞凋亡检测试验 |
| 3.3.5 细胞蛋白的提取 |
| 3.3.6 蛋白免疫印迹实验(Western Blot,WB) |
| 3.3.7 线粒体膜电位检测 |
| 3.3.8 流式细胞术检测细胞周期分布试验 |
| 3.3.9 Transwell实验 |
| 3.3.10 伤口愈合实验 |
| 3.3.11 数据统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 pCEACAM6-PE38KDEL对荧光素酶合成的抑制作用 |
| 3.4.2 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4.3 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.4.4 pCEACAM6-PE38KDEL通过线粒体途径诱导细胞凋亡 |
| 3.4.5 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.4.6 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞周期的阻滞作用 |
| 3.4.7 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞迁移能力的影响 |
| 3.4.8 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞侵袭能力的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 CEACAM6启动子调控的PE38KDEL毒素表达质粒的体内抗肿瘤活性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器及试剂 |
| 4.2.1 材料及试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 人舌鳞状细胞癌细胞皮下移植瘤动物模型的建立 |
| 4.3.2 人舌鳞状细胞癌细胞皮下移植瘤动物模型的治疗方案 |
| 4.3.3 尾静脉注射法进行小鼠体内转染 |
| 4.3.4 样本采集及切片的制作 |
| 4.3.5 H&E染色 |
| 4.3.6 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 4.3.7 Ki-67 免疫组化 |
| 4.3.8 数据统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 pCEACAM6-PE38KDEL对肿瘤生长及形成的抑制作用 |
| 4.4.2 pCEACAM6-PE38KDEL质粒对肿瘤的体内杀伤作用 |
| 4.4.3 pCEACAM6-PE38KDEL的系统毒性 |
| 4.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）抑制VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA干预骨肉瘤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题来源、研究目的、意义和国内外研究现状 |
| 1.2 论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 实验试剂配制 |
| 2.1.3 细胞计数 |
| 2.1.4 细胞株和siRNA |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验流程与方法 |
| 2.3.1 构建单靶和一链双靶siRNA |
| 2.3.2 MG-63和Saos-2 细胞的培养 |
| 2.3.3 MG-63和Saos-2 细胞的转染 |
| 2.3.4 QRT-PCR检测细胞mRNA表达 |
| 2.3.5 Western blot检测细胞蛋白表达 |
| 2.3.6 MTT法检测各转染组细胞的增殖水平 |
| 2.3.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.8 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 2.3.9 血管形成试验 |
| 2.3.10 细胞免疫组化染色 |
| 2.3.11 细胞免疫荧光染色及激光共焦距显微镜观察 |
| 2.4 统计学处理 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 骨肉瘤MG-63和Saos-2 细胞的培养 |
| 3.2 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞VEGF和Survivin m RNA和蛋白表达的影响 |
| 3.3 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.4 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞迁移的影响 |
| 3.5 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞血管形成的影响 |
| 3.6 细胞免疫组化和细胞免疫荧光化学染色结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 在攻读博士学位期间公开发表的论文与参加的项目 |
| 致谢 |
（4）新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症的诊断与治疗 |
| 1.1.1 癌症的诊断 |
| 1.1.2 癌症的治疗 |
| 1.1.3 癌症的诊疗一体化 |
| 1.2 经典的核酸结构单元用于设计纳米载体 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.2.3 分子信标 |
| 1.2.4 双链探针 |
| 1.3 金纳米颗粒 |
| 1.3.1 金纳米颗粒的理化性质 |
| 1.3.2 金纳米颗粒分布、代谢性质和毒理研究 |
| 1.3.3 金纳米颗粒在癌症诊疗中的应用研究 |
| 1.4 核酸纳米载体在癌症诊断和治疗中的研究进展 |
| 1.4.1 具有荧光特性的核酸纳米探针用于肿瘤细胞成像 |
| 1.4.2 核酸纳米载体在药物递送中的研究 |
| 1.4.3 基于核酸纳米载体的癌症诊疗一体化研究 |
| 1.5 本论文解决的科学问题及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 内源性刺激响应核靶向的纳米载体用于细胞内mRNA成像及药物递送 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 凝胶电泳实验 |
| 2.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及AuNP-mRS-DSs的制备 |
| 2.2.4 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量考察 |
| 2.2.5 特异性考察 |
| 2.2.6 杂交实验 |
| 2.2.7 细胞系及细胞培养 |
| 2.2.8 细胞内荧光成像实验 |
| 2.2.9 qRT-PCR对MRP1 mRNA进行分析 |
| 2.2.10 细胞摄取 |
| 2.2.11 阿霉素插入实验 |
| 2.2.12 细胞存活率考察 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 2.3.2 AuNP-mRS-DSs的表征 |
| 2.3.3 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量及AuNP-mRS-DSs的特异性考察 |
| 2.3.4 AuNP-mRS-DSs的选择性考察 |
| 2.3.5 细胞内荧光成像 |
| 2.3.6 细胞摄取 |
| 2.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 2.3.8 细胞存活率考察 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 多功能分子信标修饰的金纳米颗粒作为纳米载体用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 凝胶电泳实验 |
| 3.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及MBs-AuNP的制备 |
| 3.2.4 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.2.5 可行性与稳定性实验 |
| 3.2.6 细胞系及细胞培养 |
| 3.2.7 细胞内荧光成像 |
| 3.2.8 MDR1 mRNA、MRP1 mRNA和BCRP mRNA的相对表达水平分析 |
| 3.2.9 Western blotting实验 |
| 3.2.10 阿霉素插入实验 |
| 3.2.11 细胞毒性实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 3.3.2 MBs-AuNP的表征 |
| 3.3.3 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.3.4 可行性及稳定性考察 |
| 3.3.5 细胞内荧光成像 |
| 3.3.6 MBs-AuNP对细胞内耐药相关mRNA和蛋白水平的影响 |
| 3.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 3.3.8 细胞存活率实验 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体用于活细胞内端粒酶活性分析及药物递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 凝胶电泳实验 |
| 4.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的制备 |
| 4.2.4 tsDNA-AuNP的制备及其表面底物发卡修饰量的考察 |
| 4.2.5 细胞培养及HeLa细胞提取液的制备 |
| 4.2.6 HeLa细胞提取液中端粒酶活性检测 |
| 4.2.7 tsDNA-AuNP的稳定性考察 |
| 4.2.8 细胞内端粒酶活性的成像分析 |
| 4.2.9 TERT mRNA的相对表达水平分析 |
| 4.2.10 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.2.11 阿霉素插入实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 4.3.2 tsDNA-AuNP的表征 |
| 4.3.3 tsDNA-AuNP的可行性和稳定性考察 |
| 4.3.4 行走链与底物发卡修饰比例的考察 |
| 4.3.5 tsDNA-AuNP检测性能的考察 |
| 4.3.6 细胞内端粒酶活性分析的条件优化 |
| 4.3.7 不同细胞内端粒酶活性分析 |
| 4.3.8 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.3.9 纳米载体的载药量考察 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 附录 |
| 附件 |
（5）溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒对小鼠结肠癌模型免疫状态及肿瘤微环境影响的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验所用细胞系 |
| 2. 实验动物及饲养条件 |
| 3. 实验所用病毒株 |
| 4. 实验所用药物 |
| 5. 实验所用主要试剂 |
| 6. 实验用试剂和溶液配制 |
| 7. 主要耗材和仪器设备 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养相关实验 |
| 2. CCK-8细胞增殖检测实验 |
| 3. 动物模型的建立和治疗流程 |
| 4. 检测oHSV2治疗引起的特异性杀伤作用(CFSE-PI法检测细胞毒) |
| 5. 对小鼠脾脏淋巴细胞表型进行流式检测分析 |
| 6. 病理组织学切片的制备 |
| 7. 肿瘤组织RNA的提取与完整性鉴定 |
| 8. 转录组测序(RNA-Seq) |
| 9. 生物信息学分析 |
| 10. 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1. 溶瘤病毒oHSV2和化疗药物顺铂(DDP)均能有效降低CT26细胞的活力 |
| 2. 溶瘤病毒oHSV2对单侧荷瘤模型治疗效果的初步评价 |
| 3. 溶瘤病毒oHSV2治疗引起系统性的长期的抗肿瘤特异性免疫应答 |
| 4. 适应性免疫（特异性免疫）在溶瘤病毒OHSV2发挥作用的过程中起到重要作用 |
| 5. 溶瘤病毒oHSV2的应用可以增强小鼠脾脏的正向免疫 |
| 6. 溶瘤病毒oHSV2的应用可以有效改善肿瘤微环境的免疫状态 |
| 7. 溶瘤病毒oHSV2治疗可以引起肿瘤微环境中免疫相关基因的差异性表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 博士学位期间发表论文 |
| 文献综述 溶瘤病毒抗肿瘤免疫机制及其对肿瘤微环境的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）肺腺癌中两个不同免疫亚型的鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、肺腺癌中两个不同预后亚型的鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 TCGA和GEO肺腺癌队列的mRNA表达数据 |
| 1.1.2 预后相关的免疫基因 |
| 1.1.3 NMF聚类分析 |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 TCGA和GEO队列的临床特征 |
| 1.2.2 肺腺癌两个潜在的分子亚型 |
| 1.2.3 两个亚型的生存分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、肺腺癌两个亚型免疫治疗回应的预测 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 TCGA和GEO肺腺癌队列的mRNA表达数据 |
| 2.1.2 TIDE分数的预测 |
| 2.1.3 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TCGA队列中两个亚型TIDE分数的差异 |
| 2.2.2 TIDE分数在独立数据集中的验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、PD-L1表达和TMB在两个亚型的差异 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 PD-L1表达和体细胞突变数据 |
| 3.1.2 突变特征的提取和DNA损伤修复基因 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PD-L1在两个亚型的表达差异 |
| 3.2.2 TMB在两个亚型的分布差异 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、肺腺癌高风险亚型患者的通路分析 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 肺腺癌mRNA表达数据 |
| 4.1.2 差异表达基因和GSEA分析 |
| 4.1.3 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 高风险亚型通路分析结果 |
| 4.2.2 不同细胞周期检查点在两个亚型的差异表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、高风险亚型患者的显着突变基因与临床特征 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 肺腺癌体细胞突变数据和临床病理特征 |
| 5.1.2 MutSigCV算法寻找SMGs |
| 5.1.3 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 两个亚型SMGs的突变频率差异 |
| 5.2.2 两个亚型TP53突变率的验证 |
| 5.2.3 两个亚型的临床特征差异 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 免疫检查点抑制剂治疗的生物标志物概述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路对骨肉瘤细胞系凋亡的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 耗材 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 实验细胞 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.1.1 细胞复苏 |
| 2.5.1.2 细胞传代 |
| 2.5.1.3 细胞冻存 |
| 2.5.1.3.1 配制冻存液 |
| 2.5.1.3.2 消化收取细胞 |
| 2.5.1.3.3 进行冻存 |
| 2.5.2 采用MTT法检测骨肉瘤MG-63 细胞活力变化 |
| 2.5.2.1 MTT法 |
| 2.5.2.2 MTT配制方法 |
| 2.5.2.3 磷酸缓冲液(PBS)配制 |
| 2.5.2.4 贴壁细胞MTT法 |
| 2.5.2.5 MTT注意事项 |
| 2.5.3 划痕实验观察骨肉瘤MG-63 细胞的迁移能力、凋亡改变 |
| 2.5.4 透射电镜观察骨肉瘤MG-63 细胞在100μM唑来膦酸作用48h后细胞凋亡改变 |
| 2.5.4.1 透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)的原理 |
| 2.5.4.2 取材 |
| 2.5.4.3 固定 |
| 2.5.4.4 脱水 |
| 2.5.4.5 浸透 |
| 2.5.4.6 包埋和聚合 |
| 2.5.4.7 超薄切片 |
| 2.5.4.8 染色 |
| 2.5.5 流式细胞仪检测骨肉瘤MG-63、U-2OS细胞在100μM唑来膦酸作用48 h后,细胞的凋亡变化 |
| 2.5.5.1 流式细胞技术(flow cytometry,FCM) |
| 2.5.5.2 流式实施步骤 |
| 2.5.5.3 流式注意事项 |
| 2.5.6 蛋白印迹方法Western Blot(WB)检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸作用后,对AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路的影响 |
| 2.5.6.1 蛋白印迹方法原理 |
| 2.5.6.2 WB实验分组 |
| 2.5.6.3 收集细胞蛋白 |
| 2.5.6.4 测定蛋白浓度 |
| 2.5.6.5 电泳 |
| 2.5.6.6 转膜 |
| 2.5.6.7 抗体杂交 |
| 2.5.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 唑来膦酸(ZOL)抑制骨肉瘤MG-63 细胞增殖和细胞迁移 |
| 3.2 唑来膦酸通过抑制AKT/GSK-3β通路作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞 |
| 3.3 观察在抑制GSK-3β后,唑来膦酸对骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3.1 GSK-3β可以介导唑来膦酸对骨肉瘤MG-63 细胞的增殖 |
| 3.3.2 GSK-3β可以介导唑来膦酸对骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡 |
| 3.4 观察在抑制GSK-3β后,唑来膦酸对Wnt/β-Catenin通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB在癌症治疗中的应用 |
| 1.1.1 NF-κB的生物学特性 |
| 1.1.2 NF-κB的结合靶点和靶基因 |
| 1.1.3 NF-κB与肿瘤 |
| 1.2 基因编辑技术用于癌症治疗 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 系统在癌症研究中的应用 |
| 1.3 端粒酶与癌症 |
| 1.3.1 端粒和端粒酶 |
| 1.3.2 端粒酶在癌症治疗中的应用 |
| 1.4 癌症干细胞 |
| 1.4.1 CSC的生物学特性 |
| 1.4.2 CSC的分离与鉴定 |
| 1.4.3 NF-κB与 CSC |
| 1.5 本论文研究内容及意义 |
| 第二章 人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞siRNA干扰 |
| 2.3.2 RNA-seq和数据分析 |
| 2.3.3 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 2.3.4 Ch IP-seq和数据分析 |
| 2.3.5 RT-qPCR |
| 2.3.6 Ch IP-qPCR |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 NF-κB结合区域鉴定 |
| 2.4.2 增强子区NF-κB的结合 |
| 2.4.3 NF-κB差异表达基因鉴定 |
| 2.4.4 NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.5 细胞特异性NF-κB直接靶基因 |
| 2.4.6 NF-κB直接靶基因GO分析 |
| 2.4.7 NF-κB直接靶基因KEGG分析 |
| 2.4.8 编码分泌蛋白的NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.9 qPCR检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 载体构建 |
| 3.3.2 细胞培养和转染 |
| 3.3.3 Western blotting |
| 3.3.4 细胞增殖能力测定 |
| 3.3.5 相对端粒长度检测 |
| 3.3.6 病毒包装和纯化 |
| 3.3.7 病毒滴度测定 |
| 3.3.8 病毒感染 |
| 3.3.9 动物实验 |
| 3.3.10 qPCR检测 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同细胞系中NF-κB蛋白表达检测 |
| 3.4.2 Nage载体特异性验证 |
| 3.4.3 Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.4 相对端粒长度检测 |
| 3.4.5 rAAV-Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.6 Nage载体体内肿瘤治疗 |
| 3.4.7 qPCR和 Western blotting检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 细胞培养和转染 |
| 4.3.3 细胞活力和增值能力测定 |
| 4.3.4 端粒合成检测 |
| 4.3.5 相对端粒长度检测 |
| 4.3.6 病毒包装和滴度测定 |
| 4.3.7 病毒感染 |
| 4.3.8 动物实验 |
| 4.3.9 qPCR检测 |
| 4.3.10 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Tage系统特异性验证 |
| 4.4.2 细胞内端粒合成验证 |
| 4.4.3 Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.4 相对端粒长度检测 |
| 4.4.5 四碱基粘性末端Tage系统验证 |
| 4.4.6 HO酶在Tage系统中的应用 |
| 4.4.7 Tage系统优化 |
| 4.4.8 rAAV-Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.9 Tage系统体内肿瘤治疗 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 细胞培养和转染 |
| 5.3.3 病毒包装和滴度测定 |
| 5.3.4 病毒感染 |
| 5.3.5 细胞活力测定 |
| 5.3.6 RT-qPCR检测 |
| 5.3.7 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Tage系统和Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 5.4.2 Tage系统和Nage载体连续杀灭Hep G2 细胞 |
| 5.4.3 动态观察和检测残存细胞 |
| 5.4.4 rAAV杀灭残存细胞 |
| 5.4.5 rAAV-mi R533 杀灭CSC |
| 5.4.6 rAAV杀灭急性白血病细胞 |
| 5.4.7 AML CSC标志基因q PCR检测 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（9）基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术发展及应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB概述 |
| 1.1.1 NF-κB介绍 |
| 1.1.2 NF-κB与癌症 |
| 1.2 启动子改造及人工合成启动子 |
| 1.2.1 真核启动子改造 |
| 1.2.2 人工合成启动子 |
| 1.2.3 CMV启动子简介 |
| 1.3 肿瘤治疗 |
| 1.3.1 肿瘤的基因治疗 |
| 1.3.2 肿瘤的免疫治疗 |
| 1.3.3 rAAV病毒载体 |
| 1.4 研究内容和意义 |
| 第二章 基于NF-κB的高活性真核启动子研制及其应用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验材料及仪器 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 启动子的改造 |
| 2.2.4 质粒的构建 |
| 2.2.5 用细胞内表达报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.6 用单分泌报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.7 用双分泌报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.8 用EGFP报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.9 评估NF-κB对启动子活性的影响 |
| 2.2.10 启动子应用于分泌型hG-CSF蛋白的表达 |
| 2.2.11 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 HepG2和CHO细胞中突变启动子的初步改造与活性检测 |
| 2.3.2 HepG2和CHO细胞中突变启动子的深入改造和活性检测 |
| 2.3.3 用EGFP报告基因检测启动子活性 |
| 2.3.4 检测启动子的NF-κB特异性调控 |
| 2.3.5 多种细胞检测优化启动子的表达效果 |
| 2.3.6 改造启动子应用于分泌型hG-CSF蛋白的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 新型NF-κB活性抑制基因载体的构建及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂材料及仪器 |
| 3.2.2 细胞培养和转染 |
| 3.2.3 NF-κB特异性启动子表达检测 |
| 3.2.4 NF-κB特异性表达系统报告基因质粒构建 |
| 3.2.5 NF-κB靶向性miRNA表达质粒构建和筛选检测 |
| 3.2.6 构建并评估NF-κB自调控miRNA表达载体 |
| 3.2.7 荧光定量检测RelA及其靶基因的表达 |
| 3.2.8 自调控系统对细胞活力影响检测 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 NF-κB特异性启动子表达效果检测 |
| 3.3.2 DMP-amiRNA原理示意图 |
| 3.3.3 靶向于NF-κB的miRNA筛选检测 |
| 3.3.4 DMP-miRNA抑制NF-κB活性效果检测 |
| 3.3.5 DMP-amiRNA对RelA及其靶基因的调控效果检测 |
| 3.3.6 DMP-amiRNA系统对细胞活力的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因载体构建及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂材料及仪器 |
| 4.2.2 细胞培养及转染 |
| 4.2.3 质粒构建 |
| 4.2.4 分析NF-κB RelA/p65 在多个细胞中的表达水平 |
| 4.2.5 使用EGFP报告基因评估表达载体 |
| 4.2.6 使用SBP报告基因评估表达载体 |
| 4.2.7 重组AAV病毒的制备 |
| 4.2.8 重组病毒在细胞中的表达检测 |
| 4.2.9 评估重组病毒的抗肿瘤功能 |
| 4.2.10 用qPCR检测病毒分布和抗原基因表达 |
| 4.2.11 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 NF-κB依赖性肿瘤免疫疗法原理 |
| 4.3.2 NF-κB RelA/p65 在各种细胞中的表达 |
| 4.3.3 使用EGFP报告基因检测表达载体 |
| 4.3.4 使用SBP作为报告基因检测表达载体 |
| 4.3.5 重组病毒载体的构建及表达检测 |
| 4.3.6 DMP活性基因表达系统在体内的癌症治疗 |
| 4.3.7 检测小鼠不同组织中病毒分布和抗原基因 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 致谢 |
（10）基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略语(Abbreviations) |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 技术路线 |
| 文献综述一 肺癌基因治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 基因电路在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 肿瘤治疗基因合成和表达研究：基于乏氧/辐射双调控基因电路的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒的构建与鉴定及其在细胞内的诱导表达 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 C225-Fe3O4/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(靶向载基因磁性白蛋白纳米球)的制备及靶向性研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于基因和分子靶向治疗技术的靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的体内外实验研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的分子机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
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| 博士在读期间发表文章 |
四、免疫基因治疗肿瘤的应用研究（论文参考文献）
- [1]卡介苗与焦亡溶瘤策略的构建及其在宠物肿瘤治疗中的应用初探[D]. 鲁愿. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]CEACAM6启动子介导PE38KDEL毒素基因治疗人舌鳞状细胞癌的研究[D]. 郭琼. 吉林大学, 2021(01)
- [3]抑制VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA干预骨肉瘤的研究[D]. 顾军权. 苏州大学, 2021(06)
- [4]新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究[D]. 刘晓亭. 山东大学, 2020(08)
- [5]溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒对小鼠结肠癌模型免疫状态及肿瘤微环境影响的研究[D]. 胡箫. 北京协和医学院, 2020
- [6]肺腺癌中两个不同免疫亚型的鉴定[D]. 王清华. 天津医科大学, 2020(06)
- [7]唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路对骨肉瘤细胞系凋亡的作用[D]. 李胜. 中国医科大学, 2019(04)
- [8]NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究[D]. 戴薇. 东南大学, 2019(01)
- [9]基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术发展及应用研究[D]. 王丹阳. 东南大学, 2018(03)
- [10]基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究[D]. 张皓. 东南大学, 2016(02)