一、weaver基因对CAD细胞生物学功能的影响（论文文献综述）
霍叶琳,王月,安娜,杜雪[1]（2022）在《TIM-3基因在上皮性卵巢癌中高表达并促进癌细胞的增殖和迁移》文中研究表明目的通过挖掘GEPIA数据库中的基因信息,分析T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（TIM-3）基因在上皮性卵巢癌（EOC）中的表达及作用机制。方法采用GEPIA数据库在线分析TIM-3基因在EOC组织和正常卵巢组织中的表达水平。收集2018年6月～2019年12月在我院实施卵巢手术治疗的82例EOC癌变组织标本和18例正常卵巢组织标本,免疫组织化学法检测标本组织中TIM-3的表达水平,分析TIM-3表达与EOC临床病理参数的相关性;采用Kaplan-Meier Plotter分析TIM-3表达水平与EOC患者生存之间的关系。qRT-PCR法检测卵巢癌组织和正常组织标本TIM-3和Wnt1 mRNA表达水平及相关性。采用pMAGic 4.0质粒转染构建TIM-3沉默卵巢癌SKOV3细胞系,将细胞分为SKOV3组（未转染的SKOV3细胞系）、沉默阴性对照组（SKOV3+NC siRNA组:转染pMAGic 4.0 NC siRNA质粒的SKOV3细胞系）和沉默TIM-3组（SKOV3+TIM-3 siRNA组:转染pMAGic 4.0 TIM-3 siRNA质粒的SKOV3细胞系）;采用pcDNA3.1质粒转染构建TIM-3过表达卵巢癌SKOV3细胞系,将细胞分为SKOV3组、过表达阴性对照组（pcDNA NC组:转染pcDNA3.1质粒的SKOV3细胞系）和过表达TIM-3组（pcDNA TIM-3组:转染pcDNA3.1 TIM-3质粒的SKOV3细胞系）。MTT法检测细胞增殖能力,Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡能力,划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,TOPflash/FOPflash双荧光素酶报告基因实验检测Wnt/β-catenin通路活性,qPCR检测Wnt/β-catenin信号通路中转录因子TCF-7、TCFL-2及靶基因CD44的mRNA水平,Western blot检测SKOV3细胞中MMP-9,CD44、Wnt1、β-catenin及E-cad蛋白表达。结果 TIM-3在正常卵巢组织中呈阴性表达,在EOC组织中呈阳性表达,EOC组织中TIM-3阳性表达率（84.14%）显着高于正常卵巢组织（16.67%,P<0.05）。TIM-3表达与FIGO分期、组织分化程度及淋巴结是否转移有关（P<0.05）,与年龄、病理类型无关（P>0.05）。且TIM-3与Wnt1水平呈正相关（P<0.05）。沉默TIM-3基因后,Wnt/β-catenin通路活性受到抑制,SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭能力显着降低（P<0.05）,凋亡能力显着升高（P<0.05）,转录因子TCF-7、TCFL-2及靶基因CD44的mRNA水平显着下调,细胞MMP-9,CD44、Wnt1、β-catenin蛋白水平均显着下调,EMT相关蛋白E-cad水平显着上调（P<0.05）。过表达TIM-3基因后,Wnt/β-catenin通路活性被激活,SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭能力显着升高（P<0.05）,凋亡能力显着降低（P<0.05）,转录因子TCF-7、TCFL-2及靶基因CD44的mRNA水平显着上调,细胞MMP-9,CD44、Wnt1、β-catenin蛋白水平均显着上调,EMT相关蛋白E-cad水平显着下调（P<0.05）。结论 TIM-3在EOC组织中高表达,可促进卵巢癌细胞的恶性生物学行为,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。
赵巧云[2]（2021）在《PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究》文中研究说明研究背景与目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,预后较差。胃癌的发生发展经过了一系列漫长的演变过程,其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染是该演变过程中最重要的始动因子。H.pylori通过多种毒力因子如Cag A、Oip A、Vac A等调控胃上皮细胞生物学行为的改变,但其致病机制目前尚不明确。我们前期利用H.pylori 7.13和CCS9803两种野生菌株分别感染胃上皮细胞GES-1,构建体外细菌细胞共培养模型,并进行细胞转录组学测序分析和实验验证,发现H.pylori感染可上调胃上皮细胞GES-1的前列腺跨膜蛋白雄激素诱导基因1（prostate transmembrane protein androgen inducible gene 1,PMEPA1）的m RNA和蛋白的表达,提示了PMEPA1可能参与H.pylori感染相关的胃黏膜病变过程。PMEPA1是于2000年在前列腺组织中被发现的一种新型雄激素诱导基因,主要在细胞膜和亚细胞器如溶酶体、高尔基体等的亚细胞器膜上表达。已知PMEPA1基因是一种TGF-β诱导基因,负性调控TGF-β信号通路。研究发现,PMEPA1在多种肿瘤中高表达,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程。然而,PMEPA1在胃癌中的研究尚不明确,且PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜改变过程中的作用也未见报道。因此本文通过生物信息学、PMEPA1基因干预、细胞转录组学等多种方法研究了PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜病变过程中的作用及机制,为进一步挖掘H.pylori感染致病的新的分子机制及为H.pylori相关胃癌的靶向调控提供新的理论依据。材料方法:（一）PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中的表达分析:（1）利用Oncomine数据库、GEO数据库、TCGA数据库的胃癌测序数据,分析PMEPA1在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达及PMEPA1在不同劳伦分型胃癌中的表达;（2）从南昌大学第一附属医院手术室收集18对胃癌及癌旁组织标本,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）及蛋白质印迹（western blot,WB）的方法检测了PMEPA1在胃癌及癌旁组织的表达。2.PMEPA1表达与胃癌患者的预后分析:利用Kaplan-Meier Plotter在线分析数据库,评价PMEPA1与胃癌患者的总体生存期（over survival,OS）,无进展生存期（progression-free survival,FP）和进展后生存期（post-progression survival,PPS）的关系,明确PMEPA1的表达与胃癌患者预后的关系。3.PMEPA1在胃癌的诊断价值:利用p ROC包对TCGA数据库中的375例胃癌和32例正常胃黏膜组织测序样本进行受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析,并计算曲线下面积（Areas under the curve,AUC）,评估PMEPA1在胃癌的诊断价值。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）根据PMEPA1的中位表达值,将TCGA数据库的375个胃癌样本分为PMEPA1高表达组和低表达组,利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析两个差异基因集富集的生物学过程;（2）用R语言对TCGA数据库中与PMEPA1基因相关的基因进行批量计算,并对相关基因进行KEGG信号通路富集。（二）H.pylori感染及其毒力因子对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.H.pylori及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）构建H.pylori 7.13和PMSS1的oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）,并制备抗Oip A抗原的抗体,在基因和蛋白水平对oip A基因的敲除效果进行验证;（2）将H.pylori PMSS1野生菌株以不同感染复数（MOI）与胃上皮细胞GES-1共培养不同时间（1h,3h,6h,12h,24h）,检测PMEPA1蛋白表达水平,并检测感染6h时PMEPA1的m RNA表达水平;（3）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）分别以不同MOI感染AGS细胞6h,检测PMEPA1蛋白的表达水平;（4）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）、cag A基因敲除菌株（Hp7.13Δcag A和Hp PMSS1Δcag A）及oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）分别与胃上皮细胞GES-1细胞和AGS细胞共培养6h,检测PMEPA1的蛋白和m RNA表达水平。2.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:从南昌大学第一附属医院病理科收集H.pylori感染的不同胃黏膜病理阶段的内镜标本石蜡切片,通过免疫组化法检测PMEPA1的表达。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1过表达及敲减稳转细胞株的构建:分别构建过表达PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1highGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1highGES-1)、敲减PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1lowGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1lowGES-1)、过表达PMEPA1的BGC-823细胞(PMEPA1highBGC-823)及对照细胞(NC-PMEPA1highBGC-823)。2.PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响及机制:（1）通过平板克隆形成实验、实时无标记细胞分析（Real Time Cellular Analysis,RTCA）技术、CCK8法检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞增殖的影响;（2）通过transwell侵袭和迁移实验、划痕修复实验检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞侵袭和迁移的影响;（3）通过生物信息学分析TCGA数据库胃癌数据集中PMEPA1与EMT转录因子的相关性;（4）Western Blot检测EMT相关分子的蛋白表达水平。3.PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响:（1）H.pylori PMSS1的野生菌株、cag A及oip A敲除菌株感染PMEPA1highBGC-823细胞及其对照细胞,RTCA技术、transwell侵袭和迁移实验检测PMEPA1过表达对H.pylori感染的胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;（2）H.pylori 7.13野生型菌株感染PMEPA1lowGES-1及其对照细胞NC-PMEPA1lowGES-1,transwell实验检测PMEPA1敲减对H.pylori感染的胃上皮细胞的侵袭和迁移能力的影响。（四）转录组学分析PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学功能的影响1.转录组学样品准备:将Hp7.13wt和Hp PMSS1wt分别感染PMEPA1lowGES-1及NC-PMEPA1lowGES-1细胞（MOI=100）,将Hp7.13wt、Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染PMEPA1highGES-1及NC-PMEPA1highGES-1细胞（MOI=100）,H.pylori感染6h后收集细胞总RNA;同时收集PMEPA1highBGC-823及NC-PMEPA1highBGC-823细胞总RNA;每个组设置三个生物学重复,共收集48个RNA样品。2.转录组测序及分析:（1）转录组测序委托上海美吉生物医药科技有限公司,基于Illumina Novaseq 6000测序平台,通过c DNA文库构建、上机测序、测序数据质控、基因注释等步骤获得基因表达量数据;（2）利用DESeq2软件对表达基因进行差异分析,筛选标准为差异基因表达倍数（Fold Change）>1.5,校正P<0.05;（3）采用Goatools软件对差异基因进行GO富集分析,校正P<0.05为显着富集;采用R语言对差异基因进行KEGG富集分析,P<0.05为显着富集。结果:（一）PMEPA1在胃癌组织的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中高表达:（1）Oncomine数据库分析结果显示,PMEPA1在多种癌症组织中显着高表达（P<0.05）,包括乳腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌及多个消化系统肿瘤如食管癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌。（2）利用GEPIA数据库,共纳入408例TCGA胃癌样本和211例包含TCGA及GETx数据库的正常胃黏膜组织样本,分析结果显示,PMEPA1在胃癌组织样本的表达显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（3）从GEO数据库中下载三个胃癌测序数据集（GSE54129,GSE79973,GSE118916）,分析结果显示,在三个GEO数据集中,PMEPA1在胃癌组织中的转录水平均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（4）利用Oncomine数据库分析PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织中的表达情况,结果显示PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织的表达均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（5）18例胃癌及癌旁手术标本的q RT-PCR及WB结果显示,PMEPA1在胃癌组织的表达显着高于癌旁组织（P<0.05）。2.PMEPA1高表达与胃癌患者不良预后有关:Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示,PMEPA1是胃癌患者预后不良的风险因素（HR>1）,PMEPA1高表达的胃癌患者总体生存期（HR=1.52）、无进展生存期（HR=1.38）及进展治疗后生存期（HR=1.67）显着缩短（P<0.05）。3.PMEPA1诊断胃癌的临床价值:对TCGA数据库的胃癌数据集绘制PMEPA1基因的受试者工作曲线（ROC）,曲线下面积AUC为0.893,说明PMEPA1是良好的胃癌诊断标志物。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）GSEA分析结果显示,PMEPA1高表达与TGF-β、上皮间充质转化（EMT）、血管生成、缺氧、Wnt信号通路和Hedgehog信号通路显着正相关（FDR q-value<0.05）;（2）批量相关性基因的KEGG富集分析结果显示,PMEPA1及其相关性基因主要富集在E2F靶基因、有丝分裂纺锤体、MYC靶基因、蛋白质分泌、DNA修复、G2M细胞周期检查点、血管生成、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、紧密连接、EMT等信号通路,其中PMEPA1与EMT信号通路呈显着正相关（校正P值=0.005）。（二）H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.成功构建了Hp7.13和Hp PMSS1菌株的oip A基因敲除菌株,及抗Oip A抗原的兔多克隆抗体。2.H.pylori感染上调胃上皮细胞PMEPA1蛋白和m RNA表达水平:（1）前期转录组学分析结果显示,Hp7.13和Hp CCS9803菌株感染感染GES-1细胞24h,与未感染H.pylori的细胞相比,PMEPA1表达分别上调1.59倍和1.13倍,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）Hp PMSS1以不同MOI感染胃上皮GES-1细胞1、3、6、12、24h,在感染6h和12h时随着MOI增大,PMEPA1蛋白表达水平逐渐上升,在MOI=50表达水平最高（P<0.05）,PMEPA1的m RNA表达水平在感染6h时MOI=100表达最高（P<0.05）。（3）将Hp 7.13和PMSS1以不同MOI感染胃癌细胞株AGS 6h,随着MOI的增加,PMEPA1蛋白表达水平上升,其中MOI=50在两个菌株中都有统计学差异（P<0.05）。3.Hp毒力因子Cag A和Oip A对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1 6h,Western Blot结果显示,Hp7.13wt或PMSS1wt感染后PMEPA1蛋白表达高于未感染的对照组,而cag A和oip A基因敲除菌感染的PMEPA1蛋白表达低于野生组;（2）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1和AGS细胞6h,荧光定量PCR结果显示,Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染GES-1和AGS细胞后,PMEPA1的m RNA表达水平显着高于未感染细胞（P<0.05）,而cag A和oip A基因敲除菌感染时PMEPA1的m RNA表达显着低于野生菌感染的细胞（P<0.05）。4.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:（1）PMEPA1在炎细胞和腺细胞中均有表达,主要定位于细胞质及核膜。（2）在腺细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的轻度慢性非萎缩性胃炎、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）;在炎细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的重度非萎缩性炎症、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）。（3）在H.pylori感染的标本中,PMEPA1在轻度和重度非萎缩性胃炎患者标本腺细胞中的表达显着低于肠化生、异型增生和胃癌组（P<0.05）;在轻度非萎缩性胃炎的炎细胞中的表达显着低于其它各组（P<0.05）;在H.pylori未感染患者,无论是腺细胞还是炎细胞,PMEPA1的表达在胃癌组均显着高于其它各组（P<0.05）。以上结果提示,PMEPA1可能参与了H.pylori感染的胃黏膜病变过程。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖:（1）平板克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highGES-1的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;PMEPA1lowGES-1的增殖能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）体外克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highBGC-823的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;2.PMEPA1促进胃上皮和胃癌细胞的侵袭和迁移:（1）Transwell侵袭和迁移实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的侵袭和迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1lowGES-1细胞的侵袭和迁移能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）划痕修复实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）。3.PMEPA1与上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）有关:（1）利用Cbioportal数据库分析了PMEPA1与EMT有关基因的相关性,分析结果显示,PMEPA1与间充质细胞标志物N-cadherin的编码基因CDH2、Vimentin的编码基因VIM、EMT间充质细胞转录因子ZEB1、TWIST1、TWIST2显着正相关（P<0.05）,与Snail转录因子编码基因SNAI1和Slug转录因子编码基因SNAI2显着正相关（P<0.05）;与基质金属蛋白酶分子编码基因MMP11、MMP14、MMP7、MMP2、MMP1、MMP17、MMP13和MMP24显着正相关（P<0.05）;（2）Western Blot结果显示,PMEPA1lowGES-1的E-cadherin蛋白表达显着高于NC细胞（P<0.05）,N-cadherin蛋白表达显着低于NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1high GES-1则反之（P<0.05）。4.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞BGC-823增殖的影响:Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823细胞和对照细胞,RTCA结果显示,H.pylori感染18小时后开始促进NC组细胞的增殖,在感染后的40-78h内,Hp PMSS1wt菌株显着促进NC-PMEPA1highBGC-823细胞的增殖（P<0.05）,而Hp PMSS1Δcag A及Hp PMSS1Δoip A感染组与Hp PMSS1wt感染组相比,细胞增殖无统计学差异（P>0.05）;Hp PMSS1wt菌株及cag A和oip A敲除菌株对PMEPA1highBGC-823细胞的增殖无统计学差异（P>0.05）。5.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞和胃上皮细胞迁移和侵袭的影响:（1）PMEPA1过表达对H.pylori感染的BGC-823胃癌细胞迁移和侵袭的影响:H.pylori未感染组中,过表达PMEPA1显着促进BGC-823细胞的迁移和侵袭（P<0.05）;Hp7.13wt感染PMEPA1highBGC-823及对照细胞后细胞迁移和侵袭能力显着高于未感染细胞（P<0.05）,同时Hp7.13wt感染组细胞的迁移和侵袭能力显着高于Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染组（P<0.05）;Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823和NC细胞后,细胞侵袭能力同Hp7.13菌株,而迁移能力在PMEPA1highBGC-823细胞各组无统计学差异（P>0.05）。（2）PMEPA1敲减对Hp7.13wt感染的胃上皮GES-1细胞的迁移和侵袭的影响:Hp7.13wt感染PMEPA1lowGES-1及对照细胞后,细胞迁移和侵袭能力显着增加（P<0.05）。（四）转录组学分析PMEPA1在H.pylori感染的胃上皮细胞作用的生物学功能1.PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响:（1）PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞GES-1转录水平的影响:（1）GES-1过表达PMEPA1后共有1025个差异基因,敲减PMEPA1后共有1376个差异基因;（2）差异基因主要富集的GO通路有细胞运动相关如质膜黏附分子的细胞间黏附作用、趋化运动、黏附过程、细胞迁移、细胞运动、细胞外基质成分、细胞运动的调节等生物过程;（3）差异基因富集到的KEGG信号通路主要有细胞粘附分子、TGF-β、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）PMEPA1过表达对胃癌细胞株BGC-823转录水平的影响:（1）共有132个差异基因;（2）主要富集的GO通路有细胞外基质组成、组织形态发生、急性炎症反应、TGF-β的分泌调控等生物过程;（3）主要富集到的KEGG通路包括耶尔森菌感染、小细胞肺癌、内吞、抗坏血酸和醛酸代谢、肌动蛋白细胞骨架的调控、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、ECM-受体相互作用。综上,PMEPA1过表达或敲减主要影响细胞运动、迁移、细胞黏附、受体配体相关作用、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用等生物学过程。2.H.pylori感染对敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响（1）H.pylori感染对敲减PMEPA1的GES-1细胞转录水平的影响:（1）Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染PMEPA1lowGES-1细胞后,分别有2315和959个差异基因;（2）差异基因富集的GO通路相似,主要包括细胞对缺氧的反应、细胞分裂、血管发育的调控、细胞周期的正向调控、细胞运动的正向调控等生物过程;（3）共同富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）H.pylori感染对过表达PMEPA1的GES-1转录水平的影响:（1）Hp7.13wt感染NC-PMEPA1highGES-1后,共有1646个差异基因,富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路的研究、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路等;（2）Hp7.13wt与Hp7.13Δcag A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因富集到了17条信号通路,主要有肿瘤中的micro RNAs、细胞周期、P53信号通路、细胞衰老、FOXO信号通路、癌症中的转录调控异常、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路等,说明cag A可能通过以上这些通路起作用。（3）Hp7.13wt与Hp7.13Δoip A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因未富集到KEGG通路。综上,H.pylori感染可能通过转录因子的调控作用、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路介导敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的变化,其中毒力因子Cag A可能发挥重要作用。3.PMEPA1对不同H.pylori菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响（1）PMEPA1敲减对Hp7.13（或PMSS1）感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp PMSS1wt）感染PMEPA1lowGES-1及其对照组细胞,差异基因富集的KEGG通路相似,主要包括AGE-RAGE信号通路的研究、癌症中胆碱代谢、细胞衰老、Hippo信号通路、EGFR酪氨酸酶抑制耐受、癌症中的micro RNA、Fox O信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、细胞骨架调控等;（2）PMEPA1过表达对不同H.pylori菌株感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）感染PMEPA1highGES-1及其对照细胞,差异基因富集的信号通路相似,主要的GO富集有TGF-β的反应、趋化性的调节、质膜粘附分子的粘附、细胞对生长因子刺激反应等过程等生物过程;主要的KEGG富集有细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路等。综上,在H.pylori感染胃上皮细胞的过程中,PMEPA1可能通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。结论:1.PMEPA1在胃癌组织高表达,与胃癌不良预后有关,是良好的胃癌诊断标志物。2.PMEPA1高表达促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,与EMT表型相关。3.H.pylori感染调控PMEPA1的表达,促进胃上皮细胞的增殖、侵袭和迁移,部分依赖于毒力因子Cag A和Oip A的作用。4.H.pylori感染胃上皮细胞调控多种生物学过程;PMEPA1通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。
靳蜜静[3]（2021）在《脱落酸处理对猕猴桃果实抗冷性的影响及转录因子AchnABF1的功能研究》文中研究表明低温贮藏是园艺产品最重要的贮藏方式之一,它能抑制果蔬呼吸代谢、阻止衰败、延长果蔬贮藏期。然而低温引起的园艺产品冷害,是限制采后保鲜产业健康发展的重要因素。‘红阳’（Actinidia chinensis cv.Hongyang）是典型的冷敏感型猕猴桃品种,冷害问题严峻。本研究旨在探索能有效增强‘红阳’果实抗冷性,减轻冷害的处理方式,并探究其作用机制。以‘红阳’猕猴桃为材料,经不同浓度外源脱落酸（ABA）处理后转入冷库贮藏（0℃）。一方面评价不同浓度外源ABA处理对低温贮藏中‘红阳’果实冷害发生的影响,并通过测定木质素合成关键酶的活性及关键基因的转录水平,从生理生化和基因表达层面解析ABA可能发挥的调控作用机制;另一方面通过转录组测序发掘关键的冷响应转录因子家族基因,遗传转化拟南芥和番茄对其功能进行验证,探索冷信号和ABA信号可能的交叉作用。主要研究内容及结果分述如下:（1）经不同浓度ABA预处理后,在冷藏期对‘红阳’果实冷害发生情况进行为期90天的动态监测和评估。研究结果显示:外源ABA在控制‘红阳’果实冷害引起的木质化方面,存在明显的剂量效应。50 mg/L ABA处理显着地上调了木质素合成关键酶基因Ac PAL、Ac CAD和Ac POD的表达水平,并增强了PAL、CAD和POD酶活性,显着地促进了木质素在果皮和果肉组织中的合成和积累,引起果实严重的木质化;而20 mg/L ABA处理则在不同的果实部位表现出不同的调控效应。在果肉组织中显着地下调了Ac PAL、Ac CAD和Ac POD基因的表达,抑制了PAL、CAD和POD酶活性,有效地抑制了果肉组织的木质化,降低了果肉组织中木质素的含量。但在果皮组织中,却表现出刺激木质素积累的现象。通过显微观察发现,‘红阳’冷害引起的木质化先从果皮细胞开始,逐渐向果肉细胞发展。20 mg/L ABA处理促进了木质细胞在果皮部位的形成,从而在果皮形成保护屏障,降低了果实对低温的敏感性,保护了果肉细胞免受低温伤害引起木质化;且该处理减少了果肉组织中直径在40～80μm的木质细胞的数量,防止木质细胞簇的形成,对保护可食部分的品质有积极意义。（2）从‘红阳’猕猴桃基因组中鉴定得到了81个bZIP转录因子家族成员。通过构建系统发育树将81个AcbZIP分为11个亚族,分别对应拟南芥bZIP家族的A-I、K和S亚族。对在冷害温度（0℃）和非冷害温度（2℃）条件下贮藏的猕猴桃果实取样进行RNA-seq测序和转录图谱绘制。根据转录图谱筛选到6个A亚族的成员（AcbZIP12、AcbZIP17、AcbZIP18、AcbZIP31、AcbZIP69和AcbZIP72）拥有不同于其他A亚族成员的motif 17和motif 20蛋白模体,序列高度保守,受到0℃低温诱导。经过与拟南芥ABF/AREB转录因子的蛋白质多重序列比对鉴定,这6个家族成员被鉴定为ABF/AREB转录因子,并命名为AchnABF1～6。经qRT-PCR检测发现AchnABF1～6对外源ABA处理高度响应。其中AchnABF1基因在贮藏期间持续高水平表达,因此后续将重点探究该基因可能的生物学功能。（3）在拟南芥中过表达AchnABF1验证其在低温等非生物胁迫应答中的功能。结果显示:转基因株系在种子萌发期、萌发后期以及幼苗期,均表现出比野生型更强的渗透胁迫（Na Cl、甘露醇等）耐受性和ABA敏感性;低温胁迫条件下,2周大的转基因幼苗表现出比野生型更高的存活率、更少的离子泄漏和丙二醛（MDA）含量,同时AchnABF1基因的过表达还增强了一系列胁迫应答基因（RD29A、COR15A、COR47、KIN1、LTI29、CBF1和CBF2）的表达;多重胁迫处理下（高盐、干旱、低温和复合胁迫）,4周大的转基因幼苗表现出良好的抗性表型,且叶片中ROS积累较少、离子泄漏和MDA含量较少、膜脂过氧化减轻。（4）在番茄中过表达AchnABF1验证其在果实抗冷性调控中的功能。通过表型观察、显微细胞结构观察及超微亚细胞结构观察发现,转基因番茄果实比野生型番茄有更强的耐冷表型,表现为水渍化冷害症状减轻;细胞结构相对完整,质膜损伤小,叶绿体破损发生率低,并且叶绿体内淀粉粒变小。同时,转基因番茄果实中淀粉含量显着降低,可溶性糖含量升高,说明AchnABF1基因过表达促进了转基因番茄果实中淀粉向可溶性糖的转化。并且可能是通过提高细胞液浓度,保持细胞渗透势,增强细胞保水性,进而增强了转基因番茄果实的抗冷性。综上,本研究筛选出有效减轻‘红阳’果实冷害的外源ABA浓度,通过转录组分析鉴定出6个受低温响应的ABF/AREB转录因子基因,利用异源转化拟南芥和番茄的方法验证了AchnABF1基因在低温等非生物胁迫中的重要生物学功能,为进一步研究提高猕猴桃果实抗冷性提供重要参考。
杨兴玲[4]（2021）在《PYCR1在肺癌中的表达与预后价值分析及其生物学功能研究》文中研究表明背景:肺癌是全球发病率与死亡率最高的癌症,以外科切除为主的治疗方式对于部分IA期非小细胞肺癌患者术后五年生存率可达70%以上,然而对于晚期肺癌患者,5年生存率不到10%,以手术为主的治疗方案治疗效果仍不满意,对肺癌的发生发展过程及潜在机制的更深层次的研究,有助于我们更好的理解肿瘤发生与发展背后潜在的原因,并有望针对潜在的抗肿瘤靶点开发出高效的抗肿瘤治疗手段。近年的研究证实,细胞代谢酶在肿瘤中具有调节基因表达,影响细胞周期,DNA损伤修复,调节细胞增殖,存活,凋亡,以及在肿瘤微环境重建中具有重要作用,有研究表明,在肿瘤中,氨基酸匮乏会特异性引起脯氨酸合成途径过度激活,这可能导致肿瘤代谢重编程,并对肿瘤的生物学行为产生影响。吡咯啉-5-羧酸还原酶-1（Pyrroline-5-carboxylate reductase-1,PYCR1）为脯氨酸合成途径的关键酶,其表达变化引起的脯氨酸代谢途径优劣势可能影响肿瘤的生物学行为并影响肿瘤患者的生存预后,其可能成为潜在的抗肿瘤靶点或成为肿瘤预后评估的指标。近年有研究陆续报道PYCR1在结直肠癌,肝癌,肾癌等肿瘤组织中表达明显上调,并能够调节细胞增殖,转移,侵袭等,但其影响肿瘤生物学行为的直接机制及深入分析研究报道甚少,目前尚无关于PYCR1对肺癌患者预后影响的报道。PYCR1作为一种细胞代谢酶,对其更深入广泛的研究有助于我们更好的理解细胞应激调节下的代谢重编程在肿瘤发生发展中的作用及影响机制。目的:1.分别从mRNA水平,蛋白水平,表观遗传修饰水平研究PYCR1是否在肺癌患者中发生显着变化,并分析其在不同肺癌群体中的表达水平差异情况来研究其表达水平是否受个体因素影响2.通过对肺癌中PYCR1及其共表达基因网络进行功能富集分析及构建蛋白质互作网络来广泛地研究其在肺癌中可能参与或调节的生物学过程并提出其对肿瘤生物学行为影响的可能机制3.通过生存分析评价PYCR1及其同工酶PYCR2,PYCRL表达水平对肺癌患者总生存期,初次复发时间,复发后生存期的影响及其作为肺癌患者预后评价及复发预测指标的价值4.通过RNAi,Western-Blot等方法对PYCR1在肺癌中对细胞自噬现象的影响作初步研究方法:1.使用ULCAN对PYCR1在肺癌中及在肺癌患者不同群体中的表达水平进行差异分析。TCGA中515例原发肺腺癌组织与59例正常组织的RNAseq数据经R3.2.2TCGA-Assembler及PERL程序进行下载和转换,得到每百万量级转录本的基因表达值（transcripts per million,TPM）,同时从Genomic Data commons下载患者的包含肿瘤分期,病理类型,淋巴结转移状态,吸烟状态,TP53突变状态等临床信息。蛋白质表达水平数据来自CPTAC蛋白质组学数据库,包含111例肺癌组织与111例正常组织的PYCR1蛋白表达数据。ULCAN对PYCR1mRNA表达水平,蛋白表达水平,启动子甲基化水平进行亚组分析,结果以箱线图表示,包含了每组的表达水平四分位数,并对各组间进行Student’s t test统计学差异分析。2.通过ULCAN确定PYCR1及其共表达基因,对PYCR1及其534个共上调表达基因与197个负表达相关基因使用Metascape进行基因功能注释,并以KEGG通路等为来源根据系统计算的P值进行基因功能富集分析,以-log10（P）值衡量富集程度,分析前20条通路,同时更具富集条目相似性对富集结果使用Cytoscape可视化,同时对输入的基因列表使用STRING,Bio Grid,Omni Path,In Web＿IM进行蛋白质互作网络构建,以MOCODE识别并划分为不同的网络模块并进行功能富集分析。3.对来自GEO,TCGA数据库的肺癌患者基因表达数据及临床预后信息使用K-M plotter进行生存分析,对基因表达值以Best cutoff值划分为高表达与低表达组,对两组生存率以Log-Rank进行统计学差异分析。4.应用免疫组织化学法对肺腺癌患者癌组织及癌旁组织中PYCR1表达情况进行检测,应用免疫印迹法对肺癌细胞系A549,95D与人正常气道上皮细胞系BEAS-2B中的PYCR1蛋白表达情况进行检测,通过RT-PCR检测了肺癌细胞系与正常气道上皮细胞系中PYCR1mRNA表达情况。通过转染PYCR1si RNA构建PYCR1表达下调的肺癌细胞系A549,NCI-H1299,采用免疫印迹法检测了细胞自噬及其可能的上游信号通路相关分子LC3A/B,Phospho-Beclin1（Ser93）,Phospho-ULK1（Ser555）,及Phospho AMPKα,p70S6K,通过免疫荧光法检测了A549细胞系正常对照组与PYCR1表达干扰组的LC3A/B蛋白表达情况。通过转染mRFP-GFP-LC3腺病毒观察A549细胞系正常对照组与PYCR1干扰组自噬流强弱。结果:1.A)TCGA数据库中肺腺癌等24种肿瘤类型的癌组织中PYCR1mRNA表达水平均较正常组织上调。B)TCGA数据库515例肺腺癌组织与59例正常组织及不同临床特征患者PYCR1表达水平进行分层差异分析,肺腺癌组织PYCR1表达较正常组织明显升高,P值为:1.62E-12。41-60岁肺腺癌患者较61-80岁,81-100岁肺腺癌患者PYCR1表达水平升高,P值为:5.96E-04,2.70E-02。吸烟组较不吸烟组,戒烟组患者PYCR1表达平均水平升高,p值分别为:7.50E-05,3.83E-05,3.16E-02,戒烟组患者吸烟时间大于15年患者与小于15年患者PYCR1表达水平具有显着性差异,P值为:4.56E-03,不吸烟组与吸烟大于十五年已戒烟患者组PYCR1表达水平具有显着性差异,P值为:5.54E-03。各分期组间患者PYCR1表达水平无统计学差异,白种人,黑种人与亚裔种族患者组间无统计学差异,男性组与女性组间无统计学差异,混合亚型组较粘液型及非粘液型细支气管肺泡腺癌组PYCR1表达水平升高,P值为:2.31E-02,1.45E-02,实性成分为主腺癌较腺泡型腺癌PYCR1表达水平升高,P值为:3.46E-02,肺乳头状腺癌PYCR1表达水平较粘液型腺癌组高,P值为:4.11E-02。PYCR1表达水平在不同淋巴结状态患者之间无明显差异。TP53基因突变组较TP53未突变组PYCR1表达水平升高,P值为:3.58E-06。肺腺癌患者组较正常组PYCR1启动子甲基化水平无统计学差异。4期组较正常组PYCR1启动子甲基化水平减低,P值为:2.06E-02,4期组较1期组PYCR1启动子甲基化水平减低,P值为:1.46E-02。肺腺癌非裔组较正常组,肺腺癌白人组,亚裔组,PYCR1启动子甲基化水平减低,P值分别为:1.18E-04,2.03E-07,3.31E-02。PYCR1启动子甲基化水平与性别不相关。C)PYCR1启动子甲基化水平无年龄组间差异。肺癌吸烟组较正常组PYCR1启动子甲基化水平降低,P值为:5.25E-03,肺腺癌吸烟时间大于15年的戒烟患者组较肺腺癌不吸烟患者中PYCR1启动子甲基化水平高,P值为:3.12E-02。淋巴结转移状态:各组间无统计学差异。D)使用ULCAN数据库对111例肺腺癌组织与111例正常组织PYCR1蛋白表达水平进行差异分析及不同临床特征患者间进行分层差异分析,肺腺癌组较正常组PYCR1蛋白表达水平高,P值为:2.75E-3。肺腺癌各分期组间PYCR1蛋白表达水平无统计学差异,不同性别患者PYCR1蛋白表达无差异,41-60岁组患者较61-80岁组患者表达水平高,P值为1.61E-02。肥胖组较超重组PYCR1蛋白表达水平升高,P值为7.10E-06。组织学3级组较组织学2级组PYCR1表达水平升高,P值<1E-12。2.通过UALCAN网站确定了534个上调共表达基因,197个下调共表达基因,使用Metascape对PYCR1及共表达基因进行富集分析,富集到的生物学过程及细胞成分包括:Mitochondrial matrix线粒体基质,nc RNA metabolic process非编码RNA的代谢过程,lymohocyte activation白细胞的活化,Golgi-associated vesicle membrane高尔基囊泡。并在Immunologic Signatures中富集到了抗原刺激后免疫细胞活化与表达受调控的相关基因序列。对PYCR1及其共表达基因构建蛋白质蛋白质互作网络,并对各模块进行富集分析:与PYCR1具有直接作用关系的蛋白包括PYCR3,COPG1,ARCN1,COPA,CAD,HTRA2,CCT7,STIP1,PSMC5,MDH2,TBRG4,LONP1,MRM1,CHCHD1,MRPL58,PAICS,PYCR2等17个分子,PYCR1与这些分子直接作用可能参与或调节这些分子的生物学功能,对肿瘤的影响需结合这些分子的具体生物学特性及功能进一步分析,PYCR1可能在调节细胞凋亡,调节线粒体基因表达及维持线粒体基因组完整性方面具有一定作用,但仍需进一步研究。蛋白质互作网络中共生成了主要10个MCODE,对10个MCODE进行功能富集分析,他们参与的生物学过程主要包括:细胞分裂过程,核糖体蛋白复合物的生成,核糖体的生物发生,RNA的代谢,线粒体翻译,线粒体氧化呼吸链的组装,蛋白质定位到染色体的端粒区域,泛素连接酶的活性,UTP生物合成过程,PRC1复合体,Pc G蛋白复合物,IκB-α磷酸化,TLR通路信号级联反应,细胞增殖的调控,整合因子复合体。3.PYCR1高表达与肺癌患者较差的总生存期,疾病进展,及进展后生存期有关,PYCR2的表达水平对肺癌患者总生存期,疾病初次进展时间,疾病进展后生存期的影响与PYCR1相反,但PYCR2生存分析假设检验校正FDR值大于5%,PYCR2对肺癌患者生存的影响不具备统计学意义,PYCRL对肺癌患者的总生存期,疾病进展,进展后生存期无显着影响。对SLC25A10等100个共上调表达基因进行生存分析,YDJC,SLC25A39,NME1,MRPL38,CCDC137等5个分子对肺癌患者总生存期影响显着。对N4BP2L1等100个与PYCR1表达负相关的基因进行生存分析,以HR=0.7为界,N4BP2L1,GAB3,NAPSB,GIMAP2,SPN,RILPL2,ABI3BP,RORA,ARHGEF6,FRY,ADH1B,HS2ST1等12个对肺癌患者总生存期影响显着。4.免疫组织化学结果显示PYCR1蛋白在肺腺癌组织中较正常组织表达增高,Western-blot结果显示PYCR1在肺癌细胞系A549与95D中表达较正常气道上皮细胞BEAS-2B明显增高,通过转染PYCR1si RNA构建PYCR1表达下调的A549,NCI-H1299细胞系,Western-Blot检测到细胞自噬相关分子LC3II/LC3I比值上调,Phospho-Beclin1（Ser93）上调,Phospho-ULK1减低,p70S6K表达上调,P-AMPKα表达上调。提示PYCR1抑制可能会促进肺癌细胞自噬。结论:1.PYCR1在多种肿瘤中表达上调,其在多个肿瘤中的表达不具备特异性。在肺腺癌中,PYCR1mRNA表达水平在不同年龄,吸烟状态,组织学类型,TP53突变状态患者中表达存在差异,PYCR1蛋白在不同年龄,肿瘤学分级,体质指数患者中存在差异,PYCR1启动子甲基化水平与患者不同肿瘤分期,种族,吸烟状态有关,异质性是影响肿瘤患者的一个重要因素,基于细胞代谢酶PYCR1在肺癌不同临床特征组间的差异性,其可能是不同临床特征患者预后不同的潜在影响因素,但PYCR1在不同临床特征患者中的差异表达原因及机制还需进一步研究。2.PYCR1可能通过直接或间接作用影响细胞分裂,核糖体蛋白复合物的生成,核糖体的生物发生,RNA的代谢,线粒体生物合成,线粒体翻译,线粒体氧化呼吸链的组装,泛素结合酶的活性,UTP的生物合成,PRC1复合体,Pc G蛋白复合物,IκB-α磷酸化,细胞增殖调控,TLR通路信号级联反应,整合因子复合体等生物学过程或生物学分子功能调控,调控基因表达,细胞代谢等并可能在肿瘤的发生及进展中发挥一定作用。PYCR1与PYCR3,COPG1,ARCN1,COPA,CAD。HTRA2,CCT7,STIP1,PSMC5,MDH2,TBRG4,LONP1,MRM1,CHCHD1,MRPL58,PAICS,PYCR2等17个分子具有直接作用关系,其中大多为细胞代谢相关酶类及线粒体核糖体亚单位,其对肿瘤的影响需结合这些分子的具体生物学特性及功能进一步分析。3.PYCR1高表达与肺癌患者较差的总生存期,疾病进展,及进展后生存期等不良预后相关,PYCR1的共表达基因YDJC,SLC25A39,NME1,MRPL38,CCDC137,N4BP2L1,GAB3,NAPSB,GIMAP2,SPN,RILPL2,ABI3BP,RORA,ARHGEF6,FRY,ADH1B,HS2ST1同样对肺癌患者的总生存期具有较好的预测效能,本研究不纳入临床信息而单纯针对PYCR1及其以上共表达基因尝试构建的肺癌患者预后预测模型ROC曲线下面积为0.76,因此基于多个代谢酶及及肿瘤患者临床特征信息构建COX模型可能有助于评估肿瘤患者术后复发转移风险及预后情况。4.PYCR1在肺癌组织及肺癌细胞系中表达明显上调,PYCR1过表达在肺癌中可能通过间接调控ULK1,Beclin1,LC3等表达抑制肺癌细胞自噬,目前针对自噬与肿瘤相互作用关系的研究表明,细胞自噬能够抑制肿瘤,因此PYCR1表达的上调,可能通过抑制细胞自噬,对肿瘤的发生,进展具有一定的作用和影响。但还需进一步研究。
刘超[5]（2021）在《宣威女性肺腺癌分子图谱及CENPM在肺腺癌中的生物学效应研究》文中进行了进一步梳理[背景和目的]肺癌是人类发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一,且近年来发病率呈逐渐升高的趋势。在我国,肺癌是癌症相关死亡的主要原因,全国肿瘤防治形势严峻,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。而云南省宣威地区常见的恶性肿瘤就是肺癌,其发病率和死亡率居全国首位。近年来,有关宣威肺癌的研究不断深入,发现炉灶的使用方式、煤种和工业污染、吸烟、饮食习惯及遗传因素等,是宣威肺癌发病率居高不下的重要原因。虽然对于宣威肺癌的研究有很大的进步和进展,但是对于宣威肺癌的预防和诊断依然是难题。随着科学技术的不断快速发展,特别是高通量测序技术及基因芯片技术的不断革新,带动了精准医疗在肿瘤诊断和治疗领域显着进步,包括放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等治疗方法广泛在临床实践当中得到应用,也让越来越多的促进以及抑制肺癌发生发展的相关驱动基因不断被发现,而且调控肺癌相关生物学表型的信号通路也在不断被揭示。本研究将通过结合高通量测序、生物信息学分析、细胞体外实验、分子生物学技术,以及裸鼠成瘤实验等方法,全面表征宣威女性肺腺癌基因组和免疫学图谱,挖掘探究可能具有研究价值的差异表达基因及通路,开展对细胞周期蛋白CENPM的生物学功能和作用机制研究,以寻求临床上肺腺癌治疗潜在的生物标志物。第一部分 宣威女性肺腺癌的分子图谱分析研究[目的]宣威地区是中国女性肺腺癌的高发地区,这与当地居民燃煤取暖烹饪的习惯密切相关。宣威女性肺腺癌基因组和免疫学特征的全面表征对于肺癌的预防和精准治疗至关重要。[方法]本研究报告了 1 17例宣威女性肺腺癌（XWFA）的广泛基因组,转录组和免疫学特征,包括1 12例配对的肿瘤-正常组织全外显子测序（WES）特征以及33例正常组织和115例肿瘤组织的mRNA-seq特征。最后,研究建立了由局部烟煤诱导的大鼠肺癌模型。[结果]在52.68%的肿瘤样本中检测到EGFR突变,其次分别是TP53（41.07%）,RBM10（10.71%）和 KRAS（7.14%）。研究发现突变谱和转录组途径的改变显示了 XWFA和吸烟引起的肺癌样本之间存在着许多相似之处。来自TRU-W亚簇的样本高表达典型的Wnt信号通路基因,并且免疫浸润程度低,这一发现应作为临床上免疫治疗方案权衡的指标。局部烟煤诱导的大鼠肺癌模型揭示了肺癌起始阶段通路的逐步改变以及免疫浸润状态。[结论]本章节研究阐明了 XWAF的全面基因组图景,并为进一步研究其分子发病机理奠定了基础。第二部分CENPM在肺腺癌中的生物信息学分析[目的]肺癌是人类发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一,且近年来发病率呈逐渐升高的趋势。为了进一步探究肺腺癌发生发展的分子机制,我们应用了生物信息学工具,对肺腺癌中的差异表达基因进行了筛选和分析,以探究可能具有研究价值的基因及通路。[方法]本研究通过下载TCGA-LUAD和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中的GSE肺腺癌芯片数据集,使用R语言包对其进行差异表达基因的筛选;随后,将筛选出的差异基因进行功能和通路的富集分析,接着在数据库和患者样本中进行表达差异验证、临床病理特征及患者生存预后的分析,最后进行差异基因的共表达分析、富集分析和蛋白质互作网络分析。[结果]在肺腺癌中,有471个显着共同上调基因,919个显着共同下调的基因;差异表达基因在细胞周期调控相关的通路如纺锤体检测点、着丝粒DNA复制等富集显着;与正常对照组织相比,CENPM在肺腺癌中表达显着上调,其表达水平与肺腺癌患者的临床TNM分期及分型显着相关,高表达水平的CENPM是肺腺癌患者预后极显着的危险因素;差异共表达分析发现有715个基因与CENPM显着正相关,353个基因与CENPM显着负相关;CENPM差异共表达基因在mTORC1调控以及PI3K-AKT-mTOR信号转导通路中显着富集;CENPM的蛋白质相互作用网络及富集分析证实CENPM与其它细胞周期基因密切相关。[结论]肺腺癌中存在大量的差异表达基因,且在细胞周期调控相关的通路如纺锤体检测点、着丝粒DNA复制等信号通路上富集显着:CENPM在肺腺癌中异常高表达,与患者的临床病理特征及生存预后显着相关,提示CENPM可能在肺腺癌中起促癌作用,并且可能与肿瘤细胞的增殖、疾病的进展相关;CENPM差异共表达基因在mTORC1调控以及PI3K-AKT-mTOR信号转导通路中显着富集,且与CCAN蛋白家族中其它细胞周期蛋白相互作用显着,表明CENPM及其蛋白家族在PI3K-AKT-mTOR信号通路中可能扮演着重要的角色。第三部分CENPM对肺腺癌生物学行为的影响及其机制初步验证[目的]探讨上调和下调CENPM对肺腺癌细胞株A549、95D、NCI-H1975、PC-9增殖,迁移,侵袭及凋亡的影响。通过肿瘤生长曲线和免疫组化等结果在体内层面探究CENPM在体的生物学功能。使用生信分析探讨与CENPM相关的信号通路,并在动物模型中检测下游信号通路分子,明确CENPM通过信号通路介导肺腺癌相关生物学表型产生的分子机制。[方法]（1）将 LV-sh CENPM 及 CENPM OE 转染至肺腺癌细胞 A549、95D、NCI-H1975、PC-9,通过qPCR和Western blot测定转染效率,对转染成功的肺腺癌细胞进行增殖,迁移,侵袭及凋亡的检测。（2）将LV-sh CENPM,LV-sh NC转染至肺腺癌细胞A549,通过qPCR测定转染效率,并采用皮下植瘤的方式建立肺腺癌裸鼠模型。每五天观察并测量裸鼠体重及瘤体的大小,32天之后将其处死,称重并拍照。利用Western blot及免疫组化检测CENPM、MCM2、PCNA、E-cad、Vimentin在各组裸鼠瘤体中的表达情况。（3）通过下载 TCGA 和 GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中的 GSE 肺腺癌芯片数据集,使用R语言包对其进行差异表达基因的筛选;随后,将筛选出的差异基因进行功能和通路的富集分析,接着在数据库和患者样本中进行表达差异验证、临床病理特征及患者生存预后的分析,然后进行差异基因的共表达分析、富集分析和蛋白质互作网络分析,最后利用Western blot验证下游信号通路分子。[结果]（1）转染 LV-sh CENPM及CENPM OE后,肺腺癌细胞 A549、95D、NCI-H1975、PC-9中CENPM被成功的下调和上调。（2）下调CENPM能够抑制肺腺癌细胞95D、NCI-H1975的增殖能力;上调CENPM能够促进肺腺癌细胞A549、PC-9的增殖能力。（3）下调CENPM能够抑制肺腺癌细胞95D、NCI-H1975的迁移和侵袭能力;上调CENPM能够促进肺腺癌细胞H1299、SPC-A1的迁移和侵袭能力。（4）下调CENPM能够促进肺腺癌细胞95D、NCI-H1975的凋亡;上调CENPM能够抑制肺腺癌细胞A549、PC-9的凋亡。（5）下调CENPM能够抑制肺腺癌细胞中p-mTOR的表达,上调CENPM能够促进肺腺癌细胞中p-mTOR的表达;而上调和下调CENPM对肺细胞中mTOR的表达影响无明显统计学意义。（6）LV-sh CENPM组裸鼠皮下瘤体体积明显小于LV-sh NC组。（7）Western blot及免疫组化检测结果显示LV-sh CENPM组中MCM2、PCNA、（8）Vimentin的表达明显低于LV-sh NC组,而E-cad的表达明显高于LV-sh NC组。（9）GSEA分析提示CENPM与PI3K/AKT/mTOR信号通路密切相关,Western blot验证LV-sh CENPM组中p-mTOR的表达明显低于LV-sh NC组有变化,而mTOR的表达无明显变化[结论]CENPM能促进肺腺癌增殖,迁移和侵袭,抑制其凋亡,并能促进肺腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力,这表明CENPM很可能在肺腺癌中起到了促癌的作用。CENPM与PI3K/AKT/mTOR信号通路密切相关,其影响肺腺癌细胞生物学行为的机制可能是通过调控并促进p-mTOR的表达来实现的。
林兰岚[6]（2021）在《ARHGAP10在非小细胞肺癌上皮间质转化中的作用及机制研究》文中研究表明研究背景与目的:肺癌是全球主要的恶性肿瘤,非小细胞肺癌（Non-small C ell Lung Cancer,NSCLC）作为肺癌典型的病理组织学类型之一,在原发性肺癌病例中诊断率超过85%。NSCLC常规的治疗方案主要采取以手术、化疗和放疗为主的多学科综合治疗模式,但是因其具有高度侵袭性和转移性,非小细胞肺癌的五年生存率尚未取得较为满意的效果。尽管近几年来靶向治疗和免疫治疗的出现较明显改善了肺癌的疗效,然而其耐药性及其不良反应在部分程度上限制了非小细胞肺癌患者的治疗效果。因此,从分子水平深入探索肺癌的发生发展机制,筛选和鉴定调控肺癌侵袭转移的潜在致病基因有助于在临床实践中早期发现非小细胞肺癌。上皮间质转化（Epithelial M esen ch ym al Tr an si tion,E M T）作为促进癌细胞发生侵袭和迁移的主要机制之一,是非小细胞肺癌发生转移的起始和关键性因素,据报道ARHGAP10在肿瘤细胞迁移、粘附和肌动蛋白细胞骨架动态重组等多种生物学行为中具有着十分重要的作用,然而,ARHGAP10表达与非小细胞肺癌细胞上皮间质转化间的相关性尚不清楚,有待进一步探索。在本研究中,我们探讨ARHGAP10参与调控非小细胞肺癌EMT的进程与肿瘤发生的机制。方法:1.应用RT-q PCR和Western blot检测正常人肺上皮细胞BEAS-2B和SK-MES-1、A549、H1299、H1975等非小细胞肺癌株中ARHGAP10的m RNA和蛋白表达情况;2.通过慢病毒（Lentivirus）包装、感染及筛选等步骤构建稳定过表达ARHGAP10的NSCLC细胞株A549和H1299,si RNA干扰体系构建瞬时敲减ARHGAP10的NSCLC细胞H1975,对构建的非小细胞肺癌细胞株进行实验分组如下:将过表达或敲减ARHGAP10基因的NSCLC细胞株定义为过表达组（A549-ARHGAP10、H1299-ARHGAP10）和干扰组（H1975-si ARHGAP10）,将空载体的NSCLC细胞株定义为对照组（A549-mock、H1299-mock、H1975-si NC）;3.采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）、Transwell侵袭实验、细胞划痕技术测定ARHGAP10基因对NSCLC细胞的增殖活力、侵袭及迁移能力的影响;PhalloidinFITC荧光染色检测ARHGAP10基因对NSCLC细胞伪足形成和骨架重塑的影响;4.运用Western blot和免疫荧光检测A549-ARHGAP10、A549-mock和H1299-ARHGAP10、H1299-mock中EMT蛋白（E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail）的表达情况以及信号转导通路PI3K/Akt/GSK3β轴关键标志蛋白的表达水平;使用100ng/ml的IGF-1孵育细胞24h后检测不同分组细胞株中EMT标志蛋白的表达水平及对细胞增殖、侵袭的影响。结果:1.A549、H1299、H1975、SK-MES-1中ARHGAP10表达显着低于正常肺上皮,成功地建立了ARH GAP10稳定过表达NSCLC细胞株和ARH GAP10瞬时敲减NSCLC细胞株;2.ARHGAP10基因过表达的A549和H1299细胞增殖、侵袭和迁移水平显着降低,而ARHGAP10基因敲减的H1975细胞结果完全相反;细胞骨架实验显示过表达ARHGAP10后,细胞骨架纤维及伪足等明显减少,提示过表达ARHGAP10基因对细胞运动能力起抑制作用;3.Western blot和免疫荧光结果表明,在ARHGAP10过表达的NSCLC细胞中,EMT标志性蛋白E-Cadherin表达显着上调,然而S nail、N-Cad herin和Vimen tin等蛋白的表达明显下调。同时我们进一步探讨了ARH GAP10参与EMT的机制,发现PI3K/Akt/GSK3β信号转导通路中关键标志蛋白PI3 K、p-Akt和p-GSK3β的表达水平显着下调。提示ARHGAP10可能通过PI3K/Akt/GSK3β信号转导通路抑制NSCLC细胞EMT的过程,进一步通过挽救实验发现加入PI3K/Akt通路激活剂IGF-1（100ng/ml）后可以显着回复ARHGAP10对NSCLC细胞EMT的抑制作用。结论:研究结果表明ARHGAP10在非小细胞肺癌细胞中显着低表达,并与非小细胞肺癌细胞EMT密切相关。过表达ARHGAP10基因可显着抑制非小细胞肺癌细胞增殖,削弱非小细胞肺癌细胞侵袭及迁移能力;敲减ARHGAP10则表现出相反的结果。进一步研究结果表明ARHGAP10可通过调节PI3K/Akt/GSK3β轴信号转导通路抑制NSCLC上皮间质转化,从而有效抑制NSCLC细胞恶性生物学行为。
贾林·阿布扎力汗[7]（2021）在《APLP2基因变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究》文中研究说明目的:本研究旨在寻找淀粉样肽前体样蛋白2（APLP2）调控相关基因及新的变异位点,从基因/蛋白/环境多层次水平上研究其参与调控胆固醇代谢的机制与功能,为以他汀类药物为基础的高脂血症的治疗、降低心脑血管疾病的患病率和死亡率提供理论依据及新的治疗策略。1)采用极端表型策略结合二代测序技术在新疆地区人群中检测APLP2基因非同义突变位点,使用Methyltarget高通量测序法检测APLP2基因甲基化水平。2)探讨淀粉样肽前体样蛋白2（APLP2）新的变异体参与胆固醇代谢过程中的分子机制。3)探讨APLP2基因单核苷酸多态性（SNP）与新疆人群中血脂异常发生率间的关联性。方法:1)采用极端表型策略,选取新疆地区维吾尔族和哈萨克族共60例研究对象,分析APLP2基因与血脂谱的关联性。采用病例对照的研究方法,分析APLP2基因在冠心病组和对照组中的甲基化水平。2)在细胞水平上,构建APLP2基因新变异体的真核过表达质粒,采用蛋白质免疫印迹、实时定量PCR、免疫沉淀、免疫共沉淀等实验手段研究APLP2蛋白表达、稳定性、降解等本身特点及对靶蛋白Apo E/LRP1、PCSK9/LDLR的影响,探究APLP2参与调控胆固醇代谢的机制和功能。3)选择新疆地区汉族、维吾尔族及哈萨克族年龄≥35岁的人群1738例,利用Taqman技术对APLP2基因标签SNPs进行扩大样本量验证,阐述与血脂代谢的相关性。结果:1)本研究中入选的60例血脂极高和极低人群进行APLP2基因全外显子组测序,共发现11个新的未曾报道的非同义变异体（Q194E、G42E、G295S、M323I、D329N、S447N、R468C、H534Q、V535M、D573Y及P601A）,其中Q194E、G42E、M323I、S447N、R468C、及P601A非同义变异体出现在LDL-C极高组人群中,其余的均出现在LDL-C极低组人群中。冠心病患者中APLP2基因甲基化水平明显高于健康对照组研究对象。2)在细胞水平上进行机制研究结果显示:与野生型APLP2相比,APLP2 G42E变异体的蛋白表达水平明显减少,APLP2 Q194E变异体的蛋白表达水平明显增加,然而在mRNA水平上的表达与野生型无明显差异。APLP2 G42E突变体的半衰期相对较短,降解速度较快,APLP2 Q194E突变体的半衰期相对较长,降解相对缓慢。野生型APLP2能够与ApoE相互作用,与野生型相比,APLP2 G42E和APLP2 Q194E与ApoE的结合没有显着区别。APLP2野生型与LDLR有相互作用,并且是剂量依赖性增加。与野生型相比,APLP2 G42E和APLP2Q194E与PCSK9介导LDLR的降解实验无明显结果差异。3)APLP2基因rs2054247多态性位点与血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平相关（P<0.05）。APLP2基因rs2054247位点多态性与血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）相关（P<0.05）。然而,rs2054247位多态性与血清甘油三酯（TG）水平无关（P>0.05）。APLP2基因rs3740881多态性位点与血清TC、LDL-C、HDL-C和TG水平均无关（P>0.05）。APLP2 rs747180多态性位点只与TC、LDL-C水平相关（P<0.05）。结论:1)本研中在新疆地区哈萨克族和维吾尔族人群中共筛选出APLP2基因11个非同义突变位点,新疆地区人群冠心病患者中APLP2基因甲基化水平较健康对照组高。2)对APLP2基因新变异体G42E和Q194E在细胞水平上进行机制研究后发现G42E和Q194E变异体不影响胆固醇水平。同时,该两个变异体不影响与ApoE/LRP1结合,也不影响PCSK9介导LDLR的降解。3)APLP2基因rs2054247和rs747180位点多态性在新疆人群中可能与高TC和高LDL-C水平相关。ApoE基因rs429358多态性位点在新疆维吾尔族人群中可能与冠心病的发病相关。
李晓聪[8]（2020）在《Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究》文中研究表明羊绒是重要的高端纺织品原材料,随着世界范围内羊绒市场的日益扩大,对羊绒产量及质量的要求也日益提高。绒山羊作为我国优良的畜种,其羊绒品质优良,但多年来在绒山羊选育中为了提高羊绒产量盲目进行杂交,造成山羊平均产绒量和羊绒质量降低、传统良种和改良品种所占比例不高等问题。利用现代生物技术对绒山羊进行分子育种是今后绒山羊育种的重要方向。胸腺素β4具有多种生物学功能,其对毛发生长的促进作用已在很多研究中被证实,但作用机制还没有明确的定论。本研究在利用基因编辑技术获得Tβ4基因定点整合绒山羊的基础上,对Tβ4基因定点整合绒山羊进行鉴定及健康状况评价,观察Tβ4基因对绒山羊绒毛生长的影响,利用Tβ4基因定点整合绒山羊进行扩繁并对后代进行检测,进一步结合转录组学及蛋白组学分析探究Tβ4基因促进绒毛生长的机制,为今后利用基因编辑技术培育高产优质绒山羊提供理论依据。一、Tβ4基因定点整合绒山羊的检测1、Tβ4基因定点整合绒山羊的鉴定及健康状况评价本研究在利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术获得了Tβ4基因在CCR5位点定点整合绒山羊的基础上,对该基因编辑绒山羊进行了southern blot检测、Real-time PCR检测及免疫细胞化学检测,检测结果表明我们获得的绒山羊实现了Tβ4基因在CCR5位点的定点整合。另外,对基因编辑绒山羊的安全问题及健康状况进行检测,检测指标主要包括脱靶分析、插入位点CCR5基因邻近基因mRNA水平的检测、生长状况监测及血常规检测,结果表明在所检测到的潜在脱靶位点中未出现脱靶现象,CCR5邻近基因的表达也未受到影响,绒山羊的生长状况及血液指标与对照相比均无显着差异。说明Tβ4基因的定点整合并未影响整合位点周围内源基因的表达,且获得的基因编辑绒山羊生长状况及健康状况良好。2、Tβ4基因定点整合绒山羊产绒性能的检测对绒山羊的产绒性能进行检测,检测指标主要包括绒纤维强伸度、细度、绒与毛的质量比及产绒量,检测结果表明,Tβ4基因定点整合绒山羊的绒纤维强伸度及细度与对照相比无显着差异,绒与毛的质量比与对照相比显着提高,产绒量与对照相比提高了74.5%。同时,还对绒山羊的皮肤组织进行了石蜡切片HE及免疫组织化学染色,结果表明Tβ4基因定点整合绒山羊的次级毛囊与初级毛囊的比（S/P）及次级毛囊处Tβ4基因的表达与对照相比显着提高。说明Tβ4基因主要作用于次级毛囊,并通过增加次级毛囊的数量进而提高产绒量。3、Tβ4基因定点整合绒山羊的扩繁及后代的检测对Tβ4基因定点整合绒山羊进行超数排卵处理,共获得20个2-8细胞期的胚胎,将这些胚胎分别移入4只受体羊中,共得到7只后代,其中有3只后代出生后不久死亡,经PCR鉴定,死亡的3只羔羊中有2只实现了Tβ4基因定点整合,存活的4只羔羊中有3只实现Tβ4基因定点整合。对4只存活羔羊的皮肤组织进行石蜡切片、HE染色、免疫组化及Tβ4基因的qPCR检测,发现Tβ4基因定点整合的羔羊表现出了更密集的次级毛囊分布及更高的S/P,并且Tβ4基因在次级毛囊处的表达量显着提高。对3只死亡羔羊进行解剖,取各内脏器官检测Tβ4基因mRNA表达情况,结果显示3只羔羊各脏器组织中Tβ4基因mRNA表达水平无显着差异,表明Tβ4基因的定点整合只会使其在皮肤组织中高表达而不会影响该基因在其它脏器中的表达,且利用基因编辑获得的Tβ4基因定点整合绒山羊可以将其优良性状稳定遗传给后代。二、Tβ4基因促进绒山羊绒毛生长的机制研究1、Tβ4基因定点整合绒山羊的转录组学分析将对照绒山羊与Tβ4基因定点整合绒山羊的皮肤组织进行高通量转录组测序,共筛选到差异基因1076个,其中上调基因463个,下调基因613个。上调差异基因在参与的生物学过程中主要富集在肽酶活性的负调控、皮肤屏障的建立、皮肤失水的调节;在实现的分子功能中主要富集在生长因子受体的结合。下调差异基因在参与的生物学过程中主要富集在多细胞生物过程的调控、细胞粘着;在实现的分子功能中主要富集在钙离子的结合。差异基因在KEGG富集分析中显着富集在了血管平滑肌收缩信号通路、cGMP-PKG信号通路、细胞黏附分子信号通路、肾素分泌信号通路、白细胞跨内皮细胞迁移信号通路。对差异基因富集的信号通路进一步分析,筛选了关键的差异基因,发现这些差异基因主要参与细胞间的连接,调节细胞间的运动并影响血管生成、血管舒张、血管通透性的改变及血管稳定性的维持等。对这些差异基因进行了实时定量PCR验证,结果与转录组测序相符。说明Tβ4可能通过影响细胞间的连接进而影响了细胞的运动,同时还影响了毛囊周围血管的生成及血管的舒张等,最终达到了促进绒毛生长的作用。2、Tβ4基因定点整合绒山羊的蛋白组学分析及关联分析利用iTRAQ技术,分析Tβ4基因定点整合绒山羊与对照绒山羊皮肤组织中的差异蛋白,共筛选到875个差异蛋白,其中上调蛋白666个,下调蛋白209个。上调的差异蛋白在参与的生物学过程中主要富集在离子跨膜运输;在实现的分子功能中主要富集在有机阴离子跨膜转运体活性。下调的差异蛋白在参与的生物学过程中主要富集在醛生物合成的过程和组蛋白mRNA代谢过程;在实现的分子功能中主要富集在锂离子结合和碱金属离子结合。在KEGG富集分析中,差异表达的蛋白显着富集在囊泡运输中的相互作用信号通路及TRP通道炎症介质调控信号通路,筛选了关键的差异蛋白包括MAPK、CAMK、PKC等。将蛋白组学分析与转录组学分析进行关联,发现共同上调或下调的差异基因/蛋白,结合信号通路,分析结果表明Tβ4的过表达使TIMPs的表达降低,进而MMPs的表达升高,促进了基底膜及细胞外基质的降解,释放出了与蛋白多糖以非共价键连接的VEGF,VEGF与VEGFR-2结合后激活了p38 MAPK信号通路,另外,Tβ4也激活了PKC信号通路。说明Tβ4通过MAPK及PKC信号通路影响肌动蛋白的组装,影响细胞的迁移、调节细胞的增殖与分化,最终促进了毛发的生长。
张丽萌[9]（2020）在《FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究》文中研究说明FHL2（four and a half LIM domains protein 2）属于 LIM-Only 蛋白家族中的一员,其作为转录调节子参与基因表达、细胞增殖分化、细胞迁移和凋亡等诸多生理过程,当前研究多集中于人和小鼠。本课题组对连续产多羔和产单羔的绵羊卵巢组织转录组数据分析发现,FHL2在两组中的表达差异显着,推测FHL2对绵羊卵泡发育具有重要调控作用。为证实此推测,本文开展了绵羊不同组织中FHL2基因表达、绵羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息学分析、FHL2基因在绵羊卵巢及颗粒细胞中的表达及定位研究;通过构建FHL2过表达和siRNA干扰两种颗粒细胞模型,研究FHL2对绵羊颗粒细胞生长、类固醇激素分泌及相关基因表达的影响;通过构建绵羊卵巢组织的酵母双杂交CDNA文库,筛选与FHL2互作的宿主蛋白,并进行初步验证。旨在揭示FHL2调控绵羊卵泡发育的分子机制。本研究采用Real-time PCR（RT-PCR）方法检测FHL2基因在绵羊不同组织部位的表达水平;利用分子克隆技术获得绵羊FHL2基因的编码序列,生物信息学分析比较不同物种间序列同源性和进化关系;利用免疫组化技术检测FHL2蛋白在绵羊卵巢组织中的表达分布;采用细胞免疫荧光检测FHL2蛋白在卵巢颗粒细胞中的定位。结果表明:绵羊卵巢中FHL2表达水平高于其它组织,克隆得到的绵羊卵巢FHL2基因CDS为 837bp,编码 279 aa,与GenBank预测序列一致,未发生氨基酸突变,绵羊氨基酸序列与人、牛、猪、马、鸡、狗、猴同源性分别为86%、98.3%、91.7%、89.3%、76.5%、88.2%、86.2%;FHL2主要分布在绵羊卵巢的卵泡（有腔卵泡和无腔卵泡）中,亚细胞定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中。利用分子克隆技术构建真核过表达载体pcDNA3.1-FHL2,设计合成siRNA 靶向siRNA的干扰序列,转染颗粒细胞后摸索干扰效率,在体外分离培养的绵羊卵巢颗粒细胞中建立超表达和干扰两种卵巢颗粒细胞模型。结果表明:（1）成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FHL2,转染至绵羊颗粒细胞后24 h显着提高FHL2的表达;（2）成功合成3条FHL2基因的siRNA,通过RT-PCR和Western Blot检测摸索最佳转染时间和干扰效果,显示siFHL2-2在转染后72 h能够显着降低FHL2的表达。利用AlamarBlueTM HS检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,ELISA方法检测颗粒细胞雌激素和孕酮分泌变化,RT-PCR检测细胞凋亡（Bcl-2,Bax,p53和Caspase3）、细胞周期（CyclinD1,CyclinB1和p21）以及激素分泌（StAR,3β-HSD,CYP11,CYP19）相关基因的mRNA表达水平。结果表明:通过FHL2过表达模型证实:细胞转染后24 h,与对照组相比,FHL2过表达抑制绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）;正常细胞比例显着降低（P<0.05）,细胞晚期凋亡率升高（P<0.05）,检测细胞凋亡相关基因表达水平,Bcl-2表达水平显着下调（P<0.05）,Bax和Caspase3表达水平上调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值下调（P<0.01）,促进细胞凋亡;细胞周期G0/G1期和S期细胞的比例降低（P<0.001）,细胞周期因子Cyclin B1表达水平显着下调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2和P的分泌量显着降低（P<0.05）,CYP19Al、3β-HSD基因表达水平下调（P<0.05）。通过siRNA干扰模型证实:细胞转染后72 h,与对照组相比,干扰FHL2的表达能够促进绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）,检测细胞凋亡和凋亡相关基因的表达水平,正常细胞比例升高（P<0.05）,细胞晚期凋亡率降低（P<0.05）,Caspase3表达水平下调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值上调（P<0.05）,抑制细胞凋亡;细胞周期S期和G2/M期细胞的比例升高（P<0.05）,细胞周期因子Cyclin D1和p21表达上调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2分泌量升高（P<0.05）,CYP19A1、CYP11A1和StAR基因表达上调（P<0.05）。通过酵母双杂交技术构建绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交文库,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-FHL2,利用酵母双杂交文库筛选与FHL2蛋白互作的宿主蛋白。结果表明:成功构建了含有3×108个重组子的绵羊卵巢组织cDNA的酵母双杂交文库,文库滴度为2×107 cfu/mL,以及诱饵载体pGBKT-FHL2,检测诱饵载体无毒性及自激活活性。利用pGBKT7-FHL2诱饵质粒,在酵母文库中筛选出与FHL2互作的蛋白共 1 1 个（RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD）,Blast比对分析发现这些蛋白主要参与蛋白质合成、基因转录、细胞增殖分化、细胞凋亡及信号通路调控等过程。通过添加外源生长因子TGF-β1,研究在卵巢颗粒细胞中对FHL2的表达水平变化。利用TGF-β1蛋白及几个重要信号通路的抑制剂PI3K（Deguelin）、MEK（Combimetinib）、NF-κB（BAY11-7082）、JNK（SP600125）、MAPK（SB202190）处理体外培养的绵羊颗粒细胞,开展FHL2作用信号通路的试验验证。结果表明:外源添加TGF-β1蛋白使FHL2表达水平上调（P<0.05）,在此基础上,分别添加上述的信号通路抑制剂,结果显示添加PI3K和MARK信号通路抑制剂,导致FHL2表达水平下调（P<0.05）,证实PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的信号通路。综上所述,绵羊FHL2基因CDS序列全长837 bp,编码279个氨基酸,在卵巢组织中高表达,定位于卵泡颗粒细胞;FHL2影响颗粒细胞的增殖、凋亡、周期和类固醇激素（E2和P）分泌及相关基因表达;筛选获得与其互作蛋白有RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD共计11个,在绵羊卵泡发育中可能通过互作参与细胞的增殖、凋亡等信号通路过程;PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的细胞信号通路。
田萍[10]（2020）在《CBX7通过ITGβ3/TGFβ1/AKT信号通路在宫颈癌进展中的作用机制研究》文中研究说明目的:探讨色素框同源物7（CBX7）在宫颈癌中的作用,对化疗药物敏感性的影响,论证CBX7通过整合素β3（ITGβ3）/转化生长因子β1（TGFβ1）/蛋白激酶B（AKT）信号通路干扰宫颈癌上皮间质转化（EMT）的发生、宫颈癌的进展和化疗药物治疗的敏感性。方法:免疫组织化学法（IHC）检测人宫颈癌组织中CBX7及肿瘤相关基因ITGβ3、TGFβ1、磷酸化磷酯酰肌醇-3激酶（PI3K）、AKT、上皮细胞钙粘蛋白（E-cad）和波形蛋白（VIM）,回顾性收集患者临床病理信息。分析CBX7和肿瘤相关基因在癌组织与癌旁非瘤组织中表达的差异;分析CBX7与临床病理参数、肿瘤相关基因的关系;采用生存分析,评价CBX7表达对宫颈癌患者生存的影响。利用Lentivirus载体系统转染He La、Si Ha细胞,构建CBX7过表达和下调的稳定转染细胞系。将稳定转染Si Ha细胞暴露于顺铂,应用敲低CBX7 Si Ha（si CBX7 Si Ha）细胞建立移植瘤模型。采用MTT、克隆形成实验方法检测细胞生长情况;伤口愈合实验、Transwell侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭情况;流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况;检测转染不同水平CBX7细胞的成瘤率、移植瘤体积及重量;IHC、实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测移植瘤模型中CBX7及肿瘤相关基因的表达水平。利用RNAi的方法下调稳定转染细胞株中TGFβ1表达,抑制ITGβ3/TGFβ1轴;将稳定转染Si Ha细胞暴露顺铂,检测上述细胞生长、侵袭能力和凋亡情况;检测转染与未转染sh RNA TGFβ1细胞中,暴露与未暴露顺铂中CBX7及肿瘤相关基因的m RNA和蛋白的表达变化。结果:（1）CBX7的表达水平与临床分期、淋巴结转移,脉管浸润显着负相关,并随着组织分化的消除而表达下降;（2）CBX7与宫颈癌生存率呈正相关;（3）IHC检测CBX7在宫颈癌组织中阳性表达率低于癌旁非瘤组织并与ITGβ3、TGFβ1、PI3K、AKT、p-AKT和VIM负相关,与E-cad正相关;（4）稳定转染细胞的生物学行为检测,敲低CBX7促进了宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,凋亡能力明显减弱;上调CBX7提高了顺铂对Si Ha细胞的增殖抑制和凋亡作用;敲低CBX7提高了裸鼠成瘤率,增加了移植瘤模型的体积和体重;（5）IHC分析移植瘤组织结果显示,CBX7、E-cad在si CBX7组阳性表达率低于对照组;VIM高于对照组;ITGβ3、TGFβ1在si CBX7组阳性表达水平高于对照组;（6）移植瘤中ITGβ3、TGFβ1、PI3K和AKT m RNA高于对照组;（7）沉默TGFβ1的细胞生物学行为检测,沉默TGFβ1消弱了si CBX7对细胞增殖的促进作用和对凋亡的抑制作用;（8）敲低CBX7升高了ITGβ3、TGFβ1、PI3K、AKT、VIM m RNA和蛋白等表达,降低了E-cad表达;采用sh RNA TGFβ1转染逆转了si CBX7对ITGβ3、TGFβ1、PI3K、AKT、VIM m RNA和蛋白的升高,抑制了对E-cad的降低;（9）Si Ha细胞暴露于顺铂,过表达CBX7调低了ITGβ3/TGFβ1信号通路及VIM的m RNA和蛋白表达,升高了E-cad的表达。结论:CBX7在人宫颈癌组织中表达降低,CBX7是宫颈癌预后的预测因子之一;CBX7的低表达可促进宫颈癌细胞生长、迁移和侵袭,抑制凋亡,CBX7过表达提高了宫颈癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性;si CBX7调控ITGβ3/TGFβ1轴调节宫颈癌EMT的发生,沉默TGFβ1,可以部分逆转宫颈癌细胞EMT表征;CBX7通过ITGβ3/TGFβ1轴调节PI3K/AKT信号通路影响EMT的发生和化疗药物敏感性;证明CBX7在宫颈癌中是抑癌基因,可能是治疗宫颈癌的一个潜在因子,通过CBX7抑制ITGβ3/TGFβ1信号通路可能成为提高宫颈癌疗效的一种新的治疗途径。
二、weaver基因对CAD细胞生物学功能的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、weaver基因对CAD细胞生物学功能的影响（论文提纲范文）
（1）TIM-3基因在上皮性卵巢癌中高表达并促进癌细胞的增殖和迁移（论文提纲范文）
| 1 资料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 细胞和主要试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 数据库在线分析 |
| 1.3.2 免疫组化染色检测EOC组织及正常组织TIM?3表达 |
| 1.3.3 qRT?PCR检测卵巢组织中TIM?3、Wnt1 mRNA水平 |
| 1.3.4 细胞培养、分组与转染 |
| 1.3.5 MTT法检测细胞增殖 |
| 1.3.6 Annexin V?FITC/PI染色检测细胞凋亡 |
| 1.3.7 划痕实验检测细胞迁移 |
| 1.3.8 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭 |
| 1.3.9 双荧光素酶报告实验 |
| 1.3.1 0 qRT?PCR检测细胞中TCF?7、TCFL?2及CD44mRNA水平 |
| 1.3.11 Western blot检测细胞中TIM?3、MMP?9、CD44、Wnt1、β?catenin、E?cad蛋白水平 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TIM?3、Wnt1在卵巢癌组织和良性组织中的表达 |
| 2.2 沉默TIM?3基因对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 |
| 2.3 沉默TIM?3基因与Wnt/β?catenin的作用关系 |
| 2.4 过表达TIM?3基因对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 |
| 2.5 过表达TIM?3基因与Wnt/β?catenin的作用关系 |
| 3 讨论 |
（2）PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 H.pylori主要的致癌因子 |
| 1.3 H.pylori感染胃黏膜改变的关键分子PMEPA1 |
| 第2章 PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及其生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床组织标本及资料收集 |
| 2.1.2 生物信息学数据库 |
| 2.1.3 主要试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学数据挖掘 |
| 2.2.2 组织蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 2.2.3 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PMEPA1在胃癌组织中显着高表达 |
| 2.3.2 PMEPA1与胃癌患者预后的关系 |
| 2.3.3 PMEPA1诊断胃癌的临床价值 |
| 2.3.4 生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 H.pylori感染及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 临床组织标本收集 |
| 3.1.2 细胞系及实验菌株 |
| 3.1.3 质粒及感受态细胞 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 幽门螺杆菌的复苏、鉴定、传代 |
| 3.2.2 H.pylori7.13和PMSS1 oipA基因敲除菌株的构建 |
| 3.2.3 制备抗oipA重组抗原的免疫兔多克隆抗体 |
| 3.2.4 细胞培养及细菌细胞共培养模型的构建 |
| 3.2.5 蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 3.2.6 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 3.2.7 石蜡切片及免疫组织化学 |
| 3.2.8 细胞转录组学 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Hp7.13和PMSS1 菌株的oipA基因敲除菌株的构建及鉴定 |
| 3.3.2 H.pylori感染上调胃上皮细胞中PMEPA1的表达水平 |
| 3.3.3 H.pylori cag A和 oipA影响胃上皮细胞PMEPA1的表达 |
| 3.3.4 PMEPA1在不同胃黏膜病变阶段的表达及与H.pylori感染的关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒稳转细胞株的构建 |
| 4.2.2 CCK8 细胞增殖实验 |
| 4.2.3 实时无标记细胞增殖实验 |
| 4.2.4 Transwell细胞迁移和侵袭实验 |
| 4.2.5 划痕修复实验 |
| 4.2.6 克隆形成实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 成功构建PMEPA1过表达和敲减稳转细胞株 |
| 4.3.2 PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.3 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞的生物学行为的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 PMEPA1在H.pylori感染胃上皮细胞改变的转录组学研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞转录组测序流程 |
| 5.2.2 转录组测序数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 测序样品的RNA验证 |
| 5.3.2 PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响 |
| 5.3.3 Hp感染对过表达或敲减PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.3.4 PMEPA1对不同Hp菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 小结和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 PMEPA1在肿瘤中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 幽门螺杆菌外膜蛋白致病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）脱落酸处理对猕猴桃果实抗冷性的影响及转录因子AchnABF1的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 低温贮藏下的果实采后生理 |
| 1.2 采后果实的抗冷机制 |
| 1.2.1 生物膜系统与抗冷性的关系 |
| 1.2.2 渗透调节物质与抗冷性的关系 |
| 1.2.3 抗冷基因与抗冷性的关系 |
| 1.2.4 bZIP转录因子与抗冷性的关系 |
| 1.3 脱落酸的研究进展 |
| 1.3.1 脱落酸的生物合成与代谢及信号转导途径 |
| 1.3.2 脱落酸对采后园艺产品的作用 |
| 1.4 本研究的目的意义与研究内容 |
| 1.4.1 目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容与技术路线 |
| 第二章 外源脱落酸处理对‘红阳’冷害发生的影响 |
| 引言 |
| 2.1 试验材料与处理 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 木质素含量和PAL、CAD、POD酶活性的测定 |
| 2.2.2 木质化组织的化学染色和观察 |
| 2.2.3 石蜡切片的制作和显微结构观察 |
| 2.2.4 木质细胞大小测量与统计 |
| 2.2.5 RNA提取和实时荧光定量(qRT-PCR) |
| 2.2.6 数据统计分析 |
| 2.3 试验结果分析 |
| 2.3.1 外源ABA处理对‘红阳’果皮和果肉外观品质的影响 |
| 2.3.2 外源ABA处理对‘红阳’果皮和果肉中木质素含量的影响 |
| 2.3.3 外源ABA处理对木质素合成相关酶的活性和转录水平的影响 |
| 2.3.4 外源ABA处理对木质细胞形态及分布的影响 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 猕猴桃bZIP家族全基因组分析及其对冷胁迫的响应 |
| 引言 |
| 3.1 试验材料与处理 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 猕猴桃AcbZIP基因家族的全基因组鉴定 |
| 3.2.2 猕猴桃AcbZIP基因家族的进化分析和保守motifs鉴定 |
| 3.2.3 RNA提取和实时荧光定量(qRT-PCR) |
| 3.3 试验结果分析 |
| 3.3.1 猕猴桃bZIP基因家族的全基因组鉴定与分类 |
| 3.3.2 猕猴桃bZIP家族成员系统进化与保守蛋白模体分析 |
| 3.3.3 猕猴桃bZIP家族基因对低温响应的转录图谱分析 |
| 3.3.4 AchnABFs转录因子的蛋白多重序列比对分析 |
| 3.3.5 ABA处理对‘红阳’冷藏期AchnABFs表达的影响 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 AchnABF1在低温等非生物胁迫应答中的功能研究 |
| 引言 |
| 4.1 试验材料与处理 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 过表达载体p BI121:AchnABF1:GFP构建与转化 |
| 4.2.2 农杆菌侵染拟南芥 |
| 4.2.3 拟南芥胁迫处理 |
| 4.2.4 丙二醛(MDA)含量及离子泄漏率的测定 |
| 4.2.5 离体叶片活性氧(ROS)染色 |
| 4.2.6 CAT、POD活性测定 |
| 4.2.7 RNA提取和实时荧光定量(qRT-PCR) |
| 4.2.8 数据统计分析 |
| 4.3 试验结果分析 |
| 4.3.1 过表达AchnABF1对拟南芥种子萌发率的影响 |
| 4.3.2 过表达AchnABF1对拟南芥初生根长的影响 |
| 4.3.3 过表达AchnABF1对拟南芥抗冷性的影响 |
| 4.3.4 过表达AchnABF1对拟南芥抗逆性的影响 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 AchnABF1在番茄果实抗冷性方面的功能研究 |
| 引言 |
| 5.1 试验材料与处理 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 过表达载体构建 |
| 5.2.2 农杆菌介导的番茄叶盘转化 |
| 5.2.3 RNA和 DNA的提取与荧光实时定量(qRT-PCR) |
| 5.2.4 转基因番茄材料的鉴定 |
| 5.2.5 转基因番茄的处理及表型观察 |
| 5.2.6 数据统计分析 |
| 5.3 试验结果分析 |
| 5.3.1 过表达AchnABF1对番茄种子萌芽率的影响 |
| 5.3.3 过表达AchnABF1对番茄幼苗抗冷性的影响 |
| 5.3.4 过表达AchnABF1对番茄果实抗冷性及细胞结构的影响 |
| 5.3.5 过表达AchnABF1对番茄果实淀粉含量的影响 |
| 5.3.6 过表达AchnABF1对番茄果实可溶性糖含量的影响 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第六章 结论及展望 |
| 6.1 全文结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 猕猴桃bZIP基因家族信息 |
| 附录B 载体图谱 |
| 附录C 引物序列 |
| 附录D 部分试剂配方 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）PYCR1在肺癌中的表达与预后价值分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 PYCR1 在不同临床特征肺癌者中的表达差异情况 |
| 一.前言 |
| 二.研究工具与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 第二部分 PYCR1 及其共表达基因功能富集分析及蛋白互作分析 |
| 一.背景 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 第三部分 PYCR1 表达差异与肺癌患者预后的相关性 |
| 一.背景 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 第四部分 PYCR1 通过AMPK-mTOR-p70S6K通路影响肺癌细胞自噬的初步研究 |
| 一.前言 |
| 二.材料与方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 参考文献 |
| 系统综述 PYCR1 在肿瘤发生发展中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（5）宣威女性肺腺癌分子图谱及CENPM在肺腺癌中的生物学效应研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分: 宣威女性肺腺癌的分子图谱分析研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: CENPM在肺腺癌中的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: CENPM对肺腺癌生物学行为的影响及其机制初步验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 着丝粒蛋白-M在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）ARHGAP10在非小细胞肺癌上皮间质转化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略表语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 ARHGAP10在非小细胞肺癌中表达及其对细胞恶性生物学行为的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 第二部分 ARHGAP10在非小细胞肺癌EMT中作用的研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 第三部分 ARHGAP10参与非小细胞肺癌EMT进程与肿瘤发生机制的研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Rho GTP酶激活蛋白在非小细胞肺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）APLP2基因变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 新疆地区人群胆固醇代谢相关基因APLP2 新突变位点的筛查及甲基化水平检测 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂、耗材和仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学方法 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 APLP2 基因新变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂耗材及仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 胆固醇代谢相关基因APLP2 与血脂异常的关联性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 APLP2在胆固醇代谢中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（8）Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 Tβ4基因促进毛发生长的研究进展 |
| 1.1 Tβ4的分子和生化特性 |
| 1.2 Tβ4在细胞内的定位 |
| 1.3 Tβ4的功能研究进展 |
| 1.3.1 肌动蛋白结合蛋白 |
| 1.3.2 角膜修复及抗炎 |
| 1.3.3 加速皮肤伤口愈合 |
| 1.4 Tβ4促进毛发生长的研究进展 |
| 1.4.1 Tβ4通过激活毛囊干细胞促进毛发生长 |
| 1.4.2 过表达Tβ4促进牙齿异常发育及促进毛发生长 |
| 1.4.3 Tβ4 激活P38/ERK/AKT信号通路促进毛发生长 |
| 1.4.4 Tβ4 激活Wnt/β-catenin/ Lef-1 信号通路 |
| 1.4.5 Tβ4过表达增加绒山羊次级毛囊个数 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 Tβ4基因定点整合绒山羊的检测 |
| 前言 |
| 第一节 Tβ4基因定点整合绒山羊的鉴定及健康状况评价 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器设备 |
| 2.1.2 试剂耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Southern blot检测 |
| 2.2.2 Real-time PCR检测 |
| 2.2.3 免疫细胞化学检测 |
| 2.2.4 脱靶分析 |
| 2.2.5 基因位点检测 |
| 2.2.6 生长状况监测 |
| 2.2.7 血常规检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Southern blot检测 |
| 2.3.2 Real-time PCR检测 |
| 2.3.3 免疫细胞化学检测 |
| 2.3.4 脱靶分析 |
| 2.3.5 基因位点检测 |
| 2.3.6 生长状况监测 |
| 2.3.7 血常规检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第二节 Tβ4基因定点整合绒山羊产绒性能的检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 仪器设备 |
| 3.1.2 试剂耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 石蜡切片及HE染色 |
| 3.2.2 免疫组织化学 |
| 3.2.3 绒样检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 石蜡切片及HE染色 |
| 3.3.2 免疫组织化学 |
| 3.3.3 绒样检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第三节 Tβ4基因定点整合绒山羊的扩繁及后代的检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 仪器设备 |
| 4.1.2 试剂耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Tβ4基因定点整合绒山羊的超数排卵 |
| 4.2.2 胚胎移植 |
| 4.2.3 子一代PCR检测 |
| 4.2.4 子一代Real-time PCR检测 |
| 4.2.5 皮肤组织石蜡切片及HE染色 |
| 4.2.6 免疫组化 |
| 4.2.7 绒山羊各组织器官Tβ4 基因m RNA表达水平的检测 |
| 4.2.8 血常规检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 超数排卵 |
| 4.3.2 胚胎移植 |
| 4.3.3 子一代PCR检测 |
| 4.3.4 子一代Real-time PCR检测 |
| 4.3.5 石蜡切片及HE染色 |
| 4.3.6 免疫组化 |
| 4.3.7 绒山羊各组织器官Tβ4 基因m RNA表达水平的检测 |
| 4.3.8 血常规检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第三章 Tβ4基因促进绒山羊绒毛生长的机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 Tβ4基因定点整合绒山羊的转录组学分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 绒山羊皮肤样本RNA的提取 |
| 5.2.2 质控数据统计 |
| 5.2.3 序列比对分析 |
| 5.2.4 转录组质量评估 |
| 5.2.5 转录本组装 |
| 5.2.6 转录组功能注释 |
| 5.2.7 表达量分析 |
| 5.2.8 表达量差异统计 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绒山羊皮肤样本RNA的提取 |
| 5.3.2 质控数据统计 |
| 5.3.3 序列比对分析 |
| 5.3.4 转录组质量评估 |
| 5.3.5 转录本组装 |
| 5.3.6 表达量差异统计 |
| 5.3.7 差异表达基因的分析 |
| 5.3.8 差异表达基因的验证 |
| 5.4 讨论 |
| 第二节 Tβ4基因定点整合绒山羊的蛋白组学分析及关联分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 仪器设备 |
| 6.1.2 试剂耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 皮肤组织总蛋白提取 |
| 6.2.2 总蛋白质浓度测定 |
| 6.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 6.2.4 还原烷基化和酶解 |
| 6.2.5 iTRAQ标记 |
| 6.2.6 高p HUPLC第一维分离 |
| 6.2.7 液相串联质谱 |
| 6.2.8 数据质控评估 |
| 6.2.9 全蛋白功能注释 |
| 6.2.10 差异蛋白分析 |
| 6.2.11 蛋白组与转录组关联分析 |
| 6.2.12 关联分析的验证 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 蛋白浓度测定 |
| 6.3.2 数据质控评估 |
| 6.3.3 差异蛋白统计 |
| 6.3.4 差异蛋白分析 |
| 6.3.5 蛋白组与转录组关联分析 |
| 6.3.6 关联分析的验证 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及发明专利 |
（9）FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 颗粒细胞在哺乳动物卵泡发育中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵泡发育的特点 |
| 1.1.2 卵泡发育的调控 |
| 1.1.3 颗粒细胞的功能 |
| 1.1.4 颗粒细胞对卵泡发育的影响 |
| 1.1.5 颗粒细胞对卵泡闭锁的影响 |
| 1.2 FHL2基因的研究进展 |
| 1.2.1 FHL2基因的结构 |
| 1.2.2 FHL2基因的表达与细胞定位 |
| 1.2.3 FHL2基因的主要生物学功能 |
| 1.2.4 FHL2影响卵巢颗粒细胞的功能研究 |
| 1.3 蛋白质互作研究进展 |
| 1.3.1 酵母双杂交技术 |
| 1.3.2 酵母双杂交技术的特点 |
| 1.3.3 酵母双杂交技术的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及表达和定位 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 实验主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要生物信息学分析软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.2.2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及生物信息学分析 |
| 2.2.3 免疫组化分析 |
| 2.2.4 绵羊卵巢颗粒细胞的原代培养及鉴定 |
| 2.2.5 FHL2在绵羊卵巢颗粒细胞中的表达分析 |
| 2.2.6 细胞定位 |
| 2.2.7 数据统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.3.2 绵羊FHL2基因CDS序列克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.3 FHL2在绵羊卵巢组织中的表达定位 |
| 2.3.4 绵羊卵巢颗粒细胞体外培养的形态与特征 |
| 2.3.5 FHL2在体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞中的表达定位 |
| 2.3.6 Western Blot检测绵羊卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 体外分离培养绵羊原代卵巢颗粒细胞 |
| 2.4.2 FHL2的表达及细胞定位研究 |
| 2.5 小结 |
| 3 绵羊FHL2基因过表达及siRNA干扰效果研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂与耗材 |
| 3.1.3 试验主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要溶液的配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 过表达载体pcDNA3.1-FHL2转染绵羊卵巢颗粒细胞 |
| 3.2.3 siRNA的设计合成和干扰效果检测 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.2 过表达质粒转染对FHL2mRNA和蛋白表达水平的影响 |
| 3.3.3 mRNA水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.3.4 蛋白水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 主要试剂与耗材 |
| 4.1.3 试验主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 FHL2基因过表达对绵羊卵巢颗粒功能的影响 |
| 4.2.2 干扰FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响 |
| 4.2.3 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 过表达和干扰FHL2表达后对绵羊颗粒细胞形态变化的影响 |
| 4.3.2 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞增殖的影响 |
| 4.3.3 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞凋亡的影响 |
| 4.3.4 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞周期的影响 |
| 4.3.5 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞激素分泌的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 FHL2对细胞周期的影响 |
| 4.4.2 FHL2对细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 FHL2对激素分泌水平的影响 |
| 4.5 小结 |
| 5 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交CDNA文库的构建及FHL2互作蛋白的筛选 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定 |
| 5.2.2 绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 |
| 5.2.3 利用所构建酵母双杂交系统筛选与FHL2互作的蛋白 |
| 5.2.4 FHL2与筛选宿主蛋白的一对一互作验证 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绵羊卵巢酵母双杂交文库的构建 |
| 5.3.2 pGBKT7-FHL2酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.3.3 酵母双杂交互作蛋白对照实验 |
| 5.3.4 筛选与FHL2相互作用的蛋白 |
| 5.3.5 候选克隆质粒测序结果分析 |
| 5.3.6 FHL2与筛选宿主蛋白互作的验证 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 酵母双杂交cDNA文库的构建 |
| 5.4.2 酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.4.3 利用酵母双杂交筛选互作蛋白研究 |
| 5.5 小结 |
| 6 FHL2在TGF-β信号通路中对绵羊卵巢颗粒细胞的调控作用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 样品来源 |
| 6.1.2 试验主要溶液配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 绵羊TGF-β1蛋白的构建和表达 |
| 6.2.2 添加外源蛋白TGF-β1 |
| 6.2.3 FHL2表达对TGF-β1及TGF-βR基因的影响 |
| 6.2.4 TGF-β1抑制剂处理颗粒细胞 |
| 6.2.5 TGF-β1调控FHL2在不同信号通路中的作用研究 |
| 6.2.6 数据统计 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 真核表达载体pFUSERTL1-TGF-β1重组质粒的构建与鉴定 |
| 6.3.2 Western Blot鉴定TGF-β1蛋白的表达 |
| 6.3.3 TGF-β1促进卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.3.4 FHL2对TGF-β1、TGF-βR基因表达的影响 |
| 6.3.5 TGF-β信号通路对FHL2、TGF-β1和TGF-βR表达的影响 |
| 6.3.6 TGF-β1参与调控FHL2基因表达的信号通路研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 TGF-β1调控颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.4.2 TGF-β1调控FHL2基因的信号通路研究 |
| 6.5 小结 |
| 7 结论 |
| 8 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）CBX7通过ITGβ3/TGFβ1/AKT信号通路在宫颈癌进展中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 CBX7及ITGβ3/TGFβ1 信号通路相关基因在宫颈癌中的表达及其临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 CBX7 在宫颈癌生物学行为中的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞系的选取 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 裸鼠来源和饲养 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 CBX7 调控宫颈癌生物学行为的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞系的选取 |
| 1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 创新点与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 CBX在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、weaver基因对CAD细胞生物学功能的影响（论文参考文献）
- [1]TIM-3基因在上皮性卵巢癌中高表达并促进癌细胞的增殖和迁移[J]. 霍叶琳,王月,安娜,杜雪. 南方医科大学学报, 2022(02)
- [2]PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究[D]. 赵巧云. 南昌大学, 2021(01)
- [3]脱落酸处理对猕猴桃果实抗冷性的影响及转录因子AchnABF1的功能研究[D]. 靳蜜静. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]PYCR1在肺癌中的表达与预后价值分析及其生物学功能研究[D]. 杨兴玲. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [5]宣威女性肺腺癌分子图谱及CENPM在肺腺癌中的生物学效应研究[D]. 刘超. 昆明医科大学, 2021
- [6]ARHGAP10在非小细胞肺癌上皮间质转化中的作用及机制研究[D]. 林兰岚. 福建医科大学, 2021(02)
- [7]APLP2基因变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究[D]. 贾林·阿布扎力汗. 新疆医科大学, 2021(08)
- [8]Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究[D]. 李晓聪. 内蒙古大学, 2020(01)
- [9]FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究[D]. 张丽萌. 河北农业大学, 2020(01)
- [10]CBX7通过ITGβ3/TGFβ1/AKT信号通路在宫颈癌进展中的作用机制研究[D]. 田萍. 新疆医科大学, 2020