一、J亚群禽白血病病毒gp37基因的克隆和序列分析（论文文献综述）
王萌[1]（2021）在《一株E亚群禽白血病病毒的分离鉴定及致病性分析》文中进行了进一步梳理
郭雨欣,游广炬,李晓齐,高丽,郑世军,王永强[2]（2021）在《2株J亚群禽白血病病毒毒株的分离鉴定及全基因组序列分析》文中研究表明为了解我国J亚群禽白血病病毒（ALV）的流行特点和进化趋势,本试验从河北某鸡场疑似禽白血病的临床发病鸡的病料组织中,分离得到2株ALV-J毒株,分别命名为CAU2019和CAU2020。通过聚合酶链式反应（PCR）技术分段扩增分离株的全病毒基因组,连接pEASY-Blunt Zero载体后进行序列测定,并对获得的基因组序列与ALV各亚群毒株序列进行序列比对及遗传进化分析。结果表明,2个分离株与ALV各亚群毒株的gag和pol段基因相对保守,而LTR、gp85及gp37段基因变异较大。此外,CAU2019在3′UTR处有2段长度为30 bp和11 bp的不连续的碱基缺失,CAU2020在3′UTR处有1段长度为29 bp的碱基缺失。由gp85和LTR基因构建的遗传进化树可知,2个分离株在遗传关系上与J亚群毒株JS16JH9亲缘关系最近。结果表明本试验分离的2株病毒均为J亚群禽白血病病毒毒株,并且为国内ALV-J流行株的突变株。
王静[3]（2021）在《鸡Viperin蛋白与ALV-J相互作用的研究》文中认为禽白血病（Avian Leukosis,AL）是一种世界分布性疾病,由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起的禽类多种肿瘤性疾病,该病呈世界性分布,在我国被列为二类动物疫病。本病对养禽业造成了诸多方面的危害,可引起感染鸡免疫抑制和多组织器官发育迟缓,机体免疫力下降,使病禽继发感染多种疾病,严重影响其生产性能,还可通过垂直传播危害子代。有研究显示,ALV还可以污染禽用弱毒疫苗,给养殖场带来巨大威胁。目前,尚无有效的疫苗或药物应用于该病的治疗,采取严格的监测和净化措施是防控该病的主要方式。Viperin是一种干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes ISGs）能被多种病毒和细菌诱导表达,已证实具有抑制病毒复制、免疫调节和代谢调节的功能。目前,未见Viperin蛋白抑制ALV复制的相关报道。为研究鸡Viperin蛋白与ALV-J复制的相互影响,本研究首先建立了鸡Viperin基因表达水平的实时荧光定量PCR检测方法。分离鸡外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增鸡Viperin基因,构建了包含Viperin全长CDs的重组质粒。随后优化反应条件,对所建立方法的敏感性和重复性进行验证。结果显示,所建立的实时荧光定量PCR方法在107-102拷贝/μL范围内呈现良好的线性关系,最低检测限度为100拷贝/μL;重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%。应用所建立的实时荧光定量PCR方法检测1日龄正常SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、脑、外周血淋巴细胞、骨髓等组织器官的Viperin基因拷贝数,结果显示Viperin具有广泛的组织分布性。由于鸡Viperin基因与哺乳动物Viperin基因同源性差异较大,为便于后续试验,本研究表达了鸡Viperin蛋白并免疫小鼠制备多抗,将鸡Viperin基因克隆至pET32a（+）载体中构建原核表达质粒并转化至大肠杆菌BL21中,在30℃条件下加入IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明Viperin重组蛋白以包涵体的形式表达。将蛋白与弗式佐剂乳化后颈背部皮下注射BALB/c小鼠,三免后收集小鼠血清。采用Western-Blot方法确定制备多克隆抗体的特异性,检测发现该多克隆抗体可特异性识别Viperin真核表达蛋白。鸡Viperin基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及鸡Viperin蛋白多抗的制备为后续实验提供了材料基础。ALV-J SDAU1005株分别接种CEF细胞和1日龄SPF鸡,通过建立的实时荧光定量PCR方法检测Viperin基因的转录水平,研究ALV-J感染对鸡Viperin基因表达的影响。将SDAU1005株接种CEF,感染后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h收集细胞,提取总RNA,分析ALV-J感染后Viperin基因表达量。结果显示,感染病毒的CEF细胞及SPF鸡血液中Viperin基因的转录水平均明显升高,96 h时细胞中Viperin转录水平达到峰值,相应的ALV-J转录水平显着下降。为探索Viperin对ALV-J复制的影响,本研究通过过表达技术和RNA干扰技术在体外培养的细胞层面进行了检测。构建带有V5标签的真核表达质粒pcDNA-Viperin,并将其转染细胞,发现过表达Viperin可以有效干扰病毒的复制。随后,设计并合成了针对Viperin的特异性si RNA,并转染细胞。结果发现,干扰Viperin的表达产生能促进病毒复制和释放。上述结果表明,Viperin能够在体外培养的细胞上抑制ALV-J的复制。分别设计引物扩增Viperin三个活性区域的基因片段,连接至pEGFP-N1载体,构建pEGFP-N、pEGFP-SAM和pEGFP-C真核质粒,明确其作用区域。质粒转染CEF细胞后在荧光显微镜下观察到特异性绿色荧光,表明质粒转染效果良好且能表达相应蛋白。将ALV-J感染转染了相应质粒的CEF细胞,评估Viperin各区域在ALV-J复制过程中的作用。发现在转染pEGFP-N质粒的细胞中,病毒复制受到抑制,而转染pEGFP-SAM和pEGFP-C真核质粒则对ALV-J复制没有影响,证明Viperin-N活性区域在抗ALV-J复制中发挥重要作用。进一步筛选与Viperin互作的蛋白,设计引物扩增ALV-J各蛋白对应的基因片段,连接至pC-flag载体,构建了ALV-J不同编码蛋白的真核表达质粒,将各质粒与pcDNA-Viperin质粒共同转染细胞,通过激光共聚焦和免疫共沉淀实验检测Viperin与病毒基因的相互作用。激光共聚焦实验结果显示p19蛋白与Viperin共定位,免疫共沉淀实验同样确认这一结果,即证实p19蛋白与Viperin可以发生相互作用。综上所述,Viperin是抑制病毒的天然免疫因子,ALV-J感染可以诱导Viperin在体内和体外的表达;Viperin通过与p19蛋白相互作用,从而抑制ALV-J的复制,其中N结构域是Viperin发挥抗病毒作用的关键域。本文的研究加深Viperin抗病毒作用机理的认识,扩大其抗病毒谱范围,为进一步探究Viperin蛋白抵抗ALV-J的作用机理提供依据。
王呈呈[4]（2021）在《K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用》文中研究指明K亚群禽白血病病毒（ALV-K）是近些年新发现的一种外源性禽白血病病毒亚群,该亚群主要存在于中国地方鸡群,病毒增殖慢,感染范围广,是我国地方鸡群主要防控对象之一。相对其它亚群禽白血病病毒,该亚群病毒研究起步晚、感染特性和致病机制所知少、缺乏特异性诊断试剂和方法,极大限制了对该病毒深入研究和临床防控检测。本研究旨在根据ALV-K毒株的囊膜表面蛋白基因特性,利用分子生物学、细胞生物学和兽医免疫学等技术方法获得针对该病毒亚群的特异性蛋白抗原和抗体,并建立基于这些抗原抗体介导的特异性检测方法,为该亚群病毒深入研究和临床防控检测提供物质基础和方法依据。本研究首先根据Gen Bank上发表的ALV-K囊膜表面蛋白gp85基因序列,利用生物信息软件筛选出与其他亚群同源性较低的特异性抗原基因片段,设计引物,以ALV-K-JS11C1毒株的基因为模板扩增该基因片段,利用原核表达技术,获得特异性蛋白抗原;其次,对该蛋白抗原进行纯化、鉴定、包被,优化反应条件,建立检测该亚群病毒抗体的ELISA方法,对该方法的特异性、灵敏度、重复性、符合率、保存期等进行评价;第三,利用该蛋白抗原免疫接种兔,制备多克隆抗体,检测其抗体效价和对病毒或抗原的识别特性;第四,利用该蛋白抗原免疫接种Bal b/c小鼠,制备分泌抗体的脾细胞,与SP2/0细胞杂交融合,获得分泌抗体的杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞的染色体数目、分泌抗体类型和识别特性进行检测。结果显示,获得特异性的抗原基因片段大小为310bp,与目前发表的ALV-K亚群同源性为92.9%～100%,而与其他亚群同源性为37%～79.7%;系统进化树显示该基因片段与ALV-K亚群毒株基因亲缘关系很近,与其他亚群较远;蛋白结构抗原性较高。经基因克隆、诱导表达,获得大小为30k Da的目的蛋白条带。对该蛋白进行纯化和包被建立ELISA,并对抗原包被浓度、抗体稀释度、反应条件等进行优化,确定抗原包被浓度为0.75μg/m L、血清抗体稀释度为1:800、二抗稀释浓度为1:5000、一抗孵育时间为45min、二抗孵育时间为60min、显色时间10min为最佳条件;ELISA检测阴性血清临界值为0.705,能区分ALV-K与其它ALV-A/B/J亚群的鸡血清抗体;该方法灵敏度较全长蛋白提高近20倍;板内重复性变异系数在0.90%～7.33%之间,板间重复性显示变异系数在0.84%～5.44%;与商品化ALV p27抗体检测试剂盒符合率可达93.48%;试剂盒至少在5个月内有效。利用该重组蛋白免疫兔可获得效价为8.1×105～5.12×107的血清抗体,所获得的抗体可用于免疫印迹分析（Western blotting）识别ALV-K gp85蛋白和间接免疫荧光分析（IFA）识别细胞中的ALV-K病毒。通过细胞融合和多次亚克隆筛选获得两株分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为ALV-K30B、ALV-K23H,其分泌的抗体亚类分别为Ig G2b、Ig G1,制备的腹水抗体效价可达214和212,所产生的抗体可用于Western blotting特异性识别ALV-K gp85蛋白和IFA识别细胞中的ALV-K亚群毒株,而不识别ALV-A/J亚群毒株。以上结果表明,获取的ALV-K gp85特异性基因片段经诱导表达,可获得成功用于特异性检测鸡血清ALV-K抗体的ELISA包被抗原,也可成功用于制备高效价的多克隆抗体和单克隆抗体。所建立的血清抗体检测ELISA具有良好的特异性、敏感性、稳定性和符合率;所制备的特异性抗体可用于ALV-K病毒及其gp85蛋白的特异性检测。
崔文平[5]（2021）在《松花粉多糖活性组分及其靶向纳米药物抗ALV-J活性研究》文中认为ALV-J作为一种典型的反转录病毒,近些年来在鸡群中多次爆发,给养殖业造成了巨大损失。目前防控ALV-J的种鸡群净化措施存在投入大,周期长等缺点,迫切需要寻求新的方法进行有效防控。前期研究显示松花粉多糖在抗ALV-J试验中具有一定活性,但由于尚未进行深入研究,松花粉多糖抑制ALV-J复制的物质基础尚不清楚,无法解释其抗ALV-J的机制,也难以对其活性和质量进行评价控制。同时,作为一种大分子多糖,在动物体内往往存在难以透过胃肠道黏膜吸收,易被免疫系统识别,导致代谢失活的缺点。因此,研究松花粉多糖抑制ALV-J复制的物质基础,阐释其构效关系,并进一步构建合适的药物递送系统,提高其体内生物利用度和抗ALV-J活性,为ALV-J防治提供新的方法,具有重要的科学意义和研究价值。一、松花粉多糖抗ALV-J活性单体分离鉴定及构效关系研究单因素试验筛选优化提取工艺,通过总多糖提取产率确定最佳提取条件:提取温度90℃,提取溶液p H 9.0,液固比30:1,获得总多糖的最终提取率为6.5±0.19%。通过DEAE离子交换柱和sephadex G-200分子排阻色谱柱分离多糖,得到三个单体组分（PPP-1、PPP-2和PPP-3）。CCK-8试验显示各组分在800μg/m L以下无明显细胞毒性,体外抗病毒试验表明三个组分抗ALV-J活性顺序为PPP-2>PPP-3>>PPP-1。为进一步研究三个组分抗ALV-J活性的构效关系,对其分子量、单糖组成及三螺旋构象进一步分析。结果表明三个组分分子量分别为463.70、99.41和26.97 k Da,差异显着;PPP-2和PPP-3的单糖组成接近,葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量高于PPP-1,而葡萄糖含量显着偏低;刚果红试验显示只有PPP-2具有三螺旋结构,破坏PPP-2三螺旋结构后其活性明显下降。结合文献报道,初步推测松花粉多糖抗ALV-J活性构效关系如下:单糖组成是影响松花粉多糖活性的主要因素,含有酸性单糖的单体组分显示出较好的抗ALV-J活性,空间构象也是影响其活性的重要因素,三螺旋结构的保持可以提高PPP-2抗ALV-J效果,同时分子量也可能对其活性具有一定影响。本部分实验研究了松花粉多糖抑制ALV-J复制的物质基础,阐释其构效关系,为进一步研究松花粉多糖抗ALV-J活性提供了物质基础。二、松花粉多糖壳聚糖纳米药物制备及其抗ALV-J活性研究为改善松花粉多糖在体内易代谢失活的缺点,实验借助松花粉多糖和壳聚糖间的静电作用,以及壳聚糖纳米粒自组装原理,制备了松花粉多糖壳聚糖纳米药物（CS-PPPs NPs）来延长松花粉多糖在鸡体内作用时间,提高抗ALV-J活性。通过包封率、载药量及粒径对CS-PPPs NPs的制备条件进行筛选,得出最优制备工艺:壳聚糖浓度为2 mg/m L、多聚磷酸钠与壳聚糖的比例为1:8,多糖占壳聚糖的浓度10.00%,所制备的CS-PPPs NPs包封率可达91.2%,载药量达8.2%,平均粒径264 nm,PDI=0.21。体外释放实验显示所制备CS-PPPs NPs在96 h累计释放率为90%,具有较好的缓释效果;细胞实验表明,纳米粒可以携带药物进入细胞并可以缓慢释放,低于400μg/m L时,对DF-1细胞没有明显毒性作用;体外抗ALV-J活性结果表明,CS-PPPs NPs通过缓释作用延长了作用时间,提高了抗病毒效果。进一步开展实验结果表明,空白壳聚糖纳米粒没有明显的抗病毒效果,松花粉多糖溶液在短期内有较好的抗ALV-J复制的效果,但在长期实验中,PPPs组因代谢排泄效果明显下降。CS-PPPs NPs在体内显示出较好的缓释作用,在长期抗ALV-J复制中具有较好的效果,可以长时间保护鸡体,提高鸡只的免疫力和生长速度。三、基于抗体靶向的壳聚糖纳米药物递送系统增强松花粉多糖抗ALV-J活性研究为提高药物在动物体内抗病毒活性,同时减小对动物本身的毒性,本实验以松花粉多糖（PPPs）作为模型药物,以JE9抗体作为抗ALV-J指示剂,构建了新型靶向抗ALV-J纳米药物递送系统（Ab-CS-PPPs DDS）。实验通过EDC和NHS催化合成连接抗体的纳米药物（Ab-CS-PPPs NPs）,通过红外光谱、透射电镜和粒度分析仪进行表征,结果显示JE9抗体成功与壳聚糖连接,纳米药物连接抗体后,粒径、包封率、载药量及体外释放度均无显着变化。使用FITC荧光探针,考察其在细胞和动物体内对病毒的靶向性,结果显示,感染ALV-J的细胞对Ab-CS-PPPs NPs摄取更快,持续时间更长。体内实验显示,Ab-CS-PPPs NPs在感染ALV-J鸡的肝脏、肾脏、胸腺、脾脏及法氏囊上具有明显的富集性。体内外抗ALV-J实验均显示,偶联抗体后,纳米药物抑制ALV-J复制的效果提高,说明纳米递送系统对ALV-J具有较好的分布和抑制靶向性。毒理研究表明低于400μg/m L时,对DF-1细胞没有明显毒性作用;体内代谢显示偶联抗体后,纳米药物仍然具有良好的缓释作用,体外抗病毒实验结果表明,在100μg/m L的浓度下,Ab-CS-PPPs NPs可以持续抑制ALV-J的复制,在体外显示出良好的抗病毒效果。最后建立后天感染ALV-J雏鸡模型,肌肉注射CS-PPPs NPs及Ab-CS-PPPs NPs,定期观察各组鸡的临床表现及剖检病理变化,对相关指标检测表明在病毒感染的早期,Ab-CS-PPPs NPs可以持续缓慢的释放,维持稳定的药物浓度,通过药物干预可以显着降低组织的病毒载量并对感染ALV-J雏鸡的生长发育有一定的促进作用。总之,该研究通过对松花粉多糖中的单体多糖及单糖组成进行分离鉴定,研究了其抗ALV-J的活性成分,对其构效关系进行了初步分析;借助静电作用和自组装原理制备了包封率和载药量较高、具有缓释长效作用的松花粉多糖壳聚糖纳米药物;同时以松花粉多糖作为抗病毒模型药物,构建了基于抗体靶向的纳米药物递送系统,进一步提高了松花粉多糖抗ALV-J活性,为ALV-J的防治提供了新的思路和方法,同时为其它靶向抗病毒药物的研制及评价提供了参考。
李露媛[6]（2021）在《J亚群禽白血病共感染检测、病毒分离鉴定及其抗性细胞系构建》文中研究表明J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）感染可以引起鸡群的免疫抑制,诱发髓细胞型白血病和血管瘤。自从1989年首次分离于英国肉鸡,ALV-J随后在世界范围内广为流行。我国于1999年报道了首例ALV-J肉鸡感染病例。与其他亚群相比,ALV-J具有更强的致病性与传播能力以及更广泛的宿主范围,且常与其它亚群ALV以及肿瘤性病毒混合感染,给养殖业带来了严重危害。目前尚无有效的药物及疫苗可用于防控ALV-J,故当前主要防控策略是鸡群的检测和净化。因此,定期对鸡群展开ALV-J流行病学调查,分析其分子特征及演化规律,将为ALV-J防控提供流行病学依据。为了解江苏和安徽地区部分鸡群ALV以及其他肿瘤性病毒感染情况,从庐江、六安、长丰等地的养殖场鸡群中收集了疑似肿瘤的组织样品,并应用PCR方法对鸡的肿瘤性病毒ALV-A、ALV-B、ALV-K、ALV-J以及MDV和REV进行检测。结果表明,所检测的鸡群存在单一感染及多重情况的混合感染,其中被检病料的总阳性率为60.23%,而混合感染占了其中的52.83%。说明这些地区的肿瘤性病毒感染以混合感染为主。为分离出该鸡群感染的ALV,用DF-1细胞对病鸡的组织病料进行ALV的病毒分离鉴定。IFA和ALV亚群特异性PCR证明,成功分离出3株ALV-J,并命名为AH200627、AH200801与CF190512。对3个分离株的病毒全基因组进行PCR扩增、测序及序列分析,进一步发现AH200627和AH200801毒株与国内ALV-J毒株的序列同源性较高,遗传距离近;而OF190512株各个主要基因均与国内ALV-J具有一定的差异性。值得注意是,在比对CF190512的Gp85序列时发现,其第214和第215位存在两个丝氨酸的缺失。这种缺失是Genbank所有毒株均不存在的缺失类型,且该部位为Env蛋白与受体结合区域,可能会影响病毒本身的生物学特性。以上鸡群肿瘤性病毒诊断结果以及对分离的ALV-J进行序列分析为该地区的ALV-J以及其他肿瘤性病毒的防控提供了重要流行病学数据。为了研究3个ALV-J分离株的体外复制动力学,在DF-1细胞中建立了这三株病毒的复制生长曲线。结果表明,三株病毒具有相似的生长特性,但CF190512复制速率和峰值滴度均高于AH200801和AH200627。为进一步探究CF190512株Gp85第124和125位丝氨酸缺失对病毒生长特性的影响,以J1传染性克隆为骨架,构建并拯救出与CF190512具有相同缺失的重组病毒J1-delSS。病毒复制动力学分析表明,J1和J1-delSS病毒的复制曲线没有明显差异。在超感染抗性试验中,J1和J1-delSS的Env蛋白均能有效抑制J1和J1-delSS病毒的感染。该研究结果为进一步探究Gp85蛋白受体结合区域缺失对其与受体亲和力的影响打下了基础。ALV-J感染宿主细胞依赖于Env蛋白与受体结合,而此过程取决于一种功能性细胞受体chNHE1。其中,W38位色氨酸又是ALV-J侵入宿主细胞的关键。本研究中,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得敲除chNHE1的W38的抗ALV-J DF-1细胞系delW38-NHE1。Western blot结果表明,delW38-NHE1细胞系能够有效抵抗5个MOI ALV-J的感染。delW38-NHE1细胞系的成功创制为ALV-J的抗病毒研究以及通过NHE-1 W38位点与Env蛋白的互作研究提供了工具,并且该位点可作为编辑抗ALV-J转基因鸡以及作为抗病毒药物的潜在靶点。
沈逵[7]（2021）在《ALV-J编码蛋白对cGAS-STING信号通路的影响及其作用机制研究》文中研究表明禽白血病（Avian Leukosis,AL）是一种能够引起宿主产生严重免疫抑制和多种恶性肿瘤的疾病,最早发现于1908年,在我国被列为二类动物疫病。该病病原为禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）,属于反转录病毒科、正反转录病毒亚科、甲型反转录病毒属、禽α反转录病毒,该病毒既可水平传播又可垂直传播,影响鸡群生产性能,对养禽业危害严重。根据以往的报道,主要将感染鸡群的ALV分为A、B、C、D、E和J共6个亚群,其中J亚群与其他亚群抗原性差异最为显着,感染性和致病力强,系典型的外源性病毒。目前,如何控制ALV-J的流行仍是国际上的研究热点。此外,病毒是如何逃逸宿主的天然免疫系统?如何诱导机体产生免疫抑制并引发多种混合感染?以及病毒如何利用胞内免疫信号通路调控机体抗病毒物质的生成?这些问题仍未得到清晰的阐述。本研究围绕ALV-J对天然免疫信号通路cGAS-STING的抑制效果进行探讨,利用Real-time PCR、双荧光素酶报告系统,定点突变等技术方法,进一步研究ALV-J对宿主天然免疫的影响,旨在揭示ALV-J的致病机制,为疾病的研究提供新的思路。1 ALV-J编码蛋白p15可靶向性抑制cGAS-STING信号通路的活化并促进病毒在DF-1细胞中的复制为了研究ALV-J对宿主天然免疫的影响,本研究检测了 ALV-J感染DF-1细胞中IFN-β mRNA表达水平及病毒增殖情况,并在共转染cGAS和STING的情况下检测感染ALV-J后细胞中IFN-β启动子活性。实验结果显示,病毒在细胞中不断增殖并未能诱导细胞中IFN-β的表达,且能显着抑制cGAS-STING信号通路介导的IFN-β的产生。这表明ALV-J编码蛋白中可能存在拮抗该信号通路的蛋白。利用构建的双萤光素酶报告系统筛选ALV-J编码的10个结构蛋白,并使用通路的特异性激活剂（ISD,2’3’-cGAMP）激活通路,验证病毒编码蛋白抑制效果,同时在鸡巨噬细胞（HD11）中进行重复性验证。实验结果表明,ALV-J编码的p15蛋白可以显着性下调IFN-β启动子活性,使用激活剂活化通路后,在DF-1和HD11细胞中均发现p15显着抑制IFN-β的表达,且具有剂量依赖性。与此同时,p15蛋白对LPS和poly（I:C）刺激下诱导IFN-β的产生也呈现一定程度的抑制效果。此外,本研究还发现p15的过表达对病毒复制呈明显的促进作用。综合以上实验结果,ALV-J的编码蛋白p15可以靶向性抑制cGAS-STING信号通路介导的IFN-β生成,促进病毒的复制,这可能与p15蛋白的生物学功能有关。2 p15蛋白抑制cGAS-STING信号通路作用机制的初步研究ALV-J p15蛋白是一种蛋白酶,为了进一步探究p15的作用机制,本研究首先对ALV-J p15进行生物信息学分析,包括其在多个亚群中的同源性分析,酶活性位点预测等。结果发现,p15基因序列在ALV-A、B、E、J、K等多个常见亚群中氨基酸同源性保持在95%以上,且经过软件预测发现p15蛋白的37D和38S为酶活性位点。利用点突变方法将活性位点进行定点突变（37D→37A,37D38S→37A38A）,构建重组突变质粒,进一步验证突变后对cGAS-STING信号通路的抑制效果是否减弱或消失。结果显示,突变后p15蛋白对IFN-β的抑制效果有所减弱,但并未完全消失,在LPS和poly（I:C）刺激下也出现相同结果。可初步判定该37D和38S氨基酸位点为p15蛋白酶发挥作用的关键位点。为了探索p15蛋白是如何对cGAS-STING信号通路产生抑制作用的?本研究在DF-1细胞中过表达p15蛋白,检测p15对天然cGAS-STING信号通路中关键分子表达是否产生影响。然后分别与各个关键分子共转染,利用Real-time PCR、双荧光素酶报告系统检测p15在信号通路中的作用环节。实验结果显示,p15对天然信号通路中的分子表达没有抑制效果,而共转染实验中发现p15对各个通路分子的基因表达均呈现显着性抑制,故推测p15作用环节在通路下游分子入核机制或核内的基因转录过程。已报道的研究表明,cGAS-STING信号通路下游分子入核过程中扮演主要角色的是IRF-7和NF-κB。实验首先转染天然p15与突变p15表达质粒,加入激活剂激活通路,检测细胞中IRF-7和NF-κB两个分子的基因表达水平变化,随后利用双荧光素酶报告系统检测p15存在条件下两个分子的启动子激活情况。实验结果显示,p15存在下,IRF-7-luc、NF-κB-B1-luc和NF-κB-B2-1uc三个启动子均受到显着抑制;与天然p15相比,突变后p15对于NF-κB的基因表达仍是抑制作用,但对IRF-7基因表达的抑制效果完全消失,这表明p15通过酶活性中心作用于IRF-7。为了检测p15对IRF-7入核的影响,共转染IRF-7与p1 5,进行核质蛋白分离Western Blot实验,检测IRF-7的入核情况。实验结果发现,p15可显着抑制IRF-7的入核。以上结果说明,p15蛋白及其酶活性中心在病毒免疫逃避过程中扮演重要角色,p15其他的生物学作用机制有待进一步研究来阐明。3 ALV-J p15慢病毒表达载体的构建和应用已报道慢病毒作为一种十分强大且灵活的载体工具,可以实现持续的基因传递,目前已在生物学领域广泛应用。因此本研究构建了插入p15片段的骨架质粒,借助慢病毒表达系统介导p15基因在一种或多种细胞中正常表达,并通过共聚焦免疫荧光观察p15蛋白在细胞中的定位情况。实验结果显示,按照比例包装产生的慢病毒具有高效的感染能力,可有效使p15蛋白在293T细胞和LMH细胞中表达,且蛋白定位显示主要在胞浆中表达。以上实验结果表明,本研究成功建立了 ALV-J p15基因的慢病毒表达系统,这一工具将有助于揭示p15蛋白在ALV病毒感染复制,免疫抑制以及相关信号通路中的重要作用及其机制。
牛建蕊,王静,王培坤,薛聪,韩照清,于洋,王媛,张兴林[8]（2021）在《沂蒙草鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定及遗传变异分析》文中指出为了解山东沂蒙草鸡禽白血病病毒（ALV）感染情况,本试验从2个沂蒙草鸡规模化养殖场采集血浆样品184份,经DF-1细胞分离后利用ELISA试剂盒检测ALV-p27抗原。结果显示,有5份样品为ALV阳性（阳性率2.71%）。经分型引物鉴定,4份样品为A亚群禽白血病病毒,1份样品为J亚群禽白血病病毒。对J亚群禽白血病病毒（命名为SDLYU1901）进行了全基因序列测定及分析,结果发现,J亚群病毒全基因组序列与江苏蛋鸡分离株JS09GY3相似性最高,为96.4%。分离株gag、pol基因较为保守,而env基因和3′UTR基因变异程度较大。其中gp85基因与ALV-J参考株核苷酸相似性为89.7%～95.8%。3′UTR在rTM区以及DR1区域共出现205 bp的缺失。U3区序列分析结果显示,其与ALV-J原型株HPRS-103相似性最高,相似性为97.3%。试验结果表明沂蒙草鸡存在ALV感染,同时可为分析沂蒙草鸡ALV-J毒株分子特征及变异趋势提供数据支持。
闫彩虹[9]（2020）在《江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用》文中研究表明免疫抑制病病原既可引起家禽发生原发性感染甚至死亡,也可损伤其免疫系统,导致机体抵抗力下降,并发或继发感染其他病原,造成家禽生产能力下降和较高的病死率。鸡传染性贫血病毒（CIAV）、马立克病病毒（MDV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）和禽白血病病毒（ALV）是4种常见的可导致家禽免疫抑制的病毒,在我国养鸡场中检出率较高,且常以亚临床感染的形式出现。目前关于这几种免疫抑制病的流行病学调查研究主要集中在广西、安徽、山东、河南等地区,而关于江苏地区家禽这方面的流行病学研究资料较少。由MDV、REV和J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染引起的肿瘤疾病在临床诊断过程中因症状相似而较难确诊,而且这3种病原的实验室检测还是以常规PCR为主,因此建立一种特异、灵敏、快速的检测方法,用于病原检测和临床诊断,同时为疾病的防控和净化提供帮助是非常有必要的。本研究应用PCR方法对来自江苏地区的病禽进行4种免疫抑制病病原的检测,建立了同时检测3种致瘤病毒MDV、REV和ALV-J的三重TaqMan荧光定量PCR方法,并应用于临床检测中,以期了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的感染情况,并为临床上家禽肿瘤疾病的诊断提供一种快速、特异、敏感的新型技术手段。1 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测为了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的流行情况及其感染间相互作用的关系,应用PCR方法对2016-2019年来自江苏地区不同养殖群体的507只病鸡、80只病鸭、129只病鹅和42只病鸽进行CIAV、MDV、REV和ALV的核酸检测,结果显示病鸡样品总阳性检出率为66.07%,CIAV、MDV、REV和ALV的检出率分别为36.09%、25.84%、10.85%和32.94%,CIAV、MDV、REV和ALV的单一感染检出率分别为13.61%、8.88%、1.18%和12.03%,二重感染以CIAV+ALV最为常见,检出率为7.69%,三重感染以CIAV+MDV+ALV最为常见,检出率为3.94%,四重感染检出率为0.99%。不同日龄鸡检测结果显示,6月龄以上鸡CIAV的检出率显着降低,3～6月龄鸡MDV和ALV的检出率较高;不同品种鸡检测结果显示,蛋鸡MDV、REV检出率显着高于肉鸡、草鸡和三黄鸡;2016-2019年检测结果显示,江苏地区鸡群中免疫抑制病病毒仍呈现不同程度的流行,且部分病原的每年检出率存在差异性。4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较经统计学分析表明,CIAV和REV、CIAV和ALV感染间存在相互促进的趋势（P<0.01）。209份水禽样品均未检测出CIAV核酸,MDV、REV和ALV的检出率分别为0.96%、1.44%和3.35%,个别样品还存在REV和ALV的混合感染。病鸽样品中均未检测出这四种免疫抑制病病原。结果表明,鸡群中免疫抑制病病原的感染非常普遍,且存在多种病原的混合感染;水禽中免疫抑制病病原的检出率显着低于鸡群;鸽子感染这4种免疫抑制病病原的机率较低。2鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立为建立同时检测MDV、REV和ALV-J的方法,本研究根据MDV meq基因、REV gp90基因和ALV-J env基因,合成特异性引物和TaqMan探针,建立和优化反应体系和条件,建立了鸡3种致瘤病毒的单个和三重TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的3种病毒的单个荧光定量PCR方法具有相同的反应体系和条件,操作方便,检测快速;单个和多重荧光定量PCR方法均仅特异性扩增MDV、REV和ALV-J,与鸡其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;3种病毒的单个荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×101拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,敏感性较高,三重荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×100拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,与单个敏感性相似;三重荧光定量PCR方法组内与组间重复性试验的Ct值变异系数均小于5%,重复性良好。应用三重荧光定量PCR方法和普通PCR方法分别对来自江苏各地具有免疫抑制病表现的120份临床病鸡样品同时进行MDV、REV和ALV-J核酸的检测,两者的符合率为94.17%。本研究建立的鸡致瘤病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法为临床样品中MDV、REV和ALV-J核酸的检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感的新型技术手段。3两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究为进一步检验三重荧光定量PCR方法的临床应用性,应用建立的三重荧光定量PCR方法对江苏两个鸡场送检的疑似感染肿瘤性病毒的病鸡组织样品进行了检测,并同时进行病毒分离,然后对分离出的MDV野毒株进行meq和pp38两个主要致病基因的序列分析。三重荧光定量PCR结果显示送检病鸡样品MDV核酸均呈阳性,REV和ALV-J核酸均呈阴性,病毒分离鉴定结果显示从两个鸡场的病鸡抗凝全血中各分离到了 1株MDV Ⅰ型毒株,未分离到REV和ALV毒株。核苷酸同源性和遗传进化分析结果显示,JS0316毒株与江苏分离株Js201801关系最近,而JS0424毒株则与近年国内流行毒株亲缘相近。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征（A71S,P194-）,具有MDV强毒分离株的分子特征（D80Y,V115A,T139A,P176R）,JS0316分离株meq基因除了具有以上强毒分离株的分子特征外,还与Js201801存在相同的突变（Q93R）,该突变其余参考毒株均未发生,这可能是MDV江苏分离株新的分子生物学特征。除此之外,JS0316和JS0424分离株meq基因分别出现了其他参考毒株均未发生的氨基酸突变（V123A）和（A/P217T）,JS0316和JS0424分离株pp38基因推导的氨基酸序列也分别出现了特有的氨基酸突变（L981,F240S）和（W67G,V210A）。结果表明三重荧光定量PCR检测结果和病毒分离结果一致,发病鸡均感染了马立克病毒,且分离毒株均具有强毒的分子特征。因此,所建三重荧光定量PCR方法可用于临床检测。
栾秀敏[10]（2020）在《2017-2019年我国部分省份白羽肉鸡ALV-J的分离鉴定及env序列分析》文中进行了进一步梳理禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）感染引发的多种肿瘤病的统称,临床症状主要表现为多种脏器肿瘤、免疫抑制和严重的生长迟缓。该病在19世纪末出现以来,已在世界范围内广泛流行。该病于20世纪末在我国开始流行并在2008年达到高峰,严重影响了我国商品肉鸡和蛋鸡的养殖,造成了巨大的经济损失。为控制禽白血病的流行与传播,我国对禽白血病实施了严格的净化工作,力求从种源净化做起,在全国范围内逐步净化禽白血病。目前,禽白血病净化工作已经取得了巨大成功,尤其是J亚群禽白血病病毒（subgroup J ALV,ALV-J）在我国商品肉鸡和蛋鸡养殖业中得到一定控制,经济效益得到了明显提升。然而,2017年以来,我国多个省份肉种鸡场再次出现禽白血病,临床症状较之前出现变化,发病率和死亡率显着提高。为了解引发此次禽白血病发生的病原学特征,本研究从我国辽宁、吉林、天津、山东、河北和江苏六个省份21家发生禽白血病症状的养殖场进行了系统的流行病学分析。生产数据显示上述养殖场患病鸡临床症状主要出现于开产前后,发病平均周龄为17.5周,平均日死亡率为6.8/10000。主要症状表现为肝脏肿瘤、脾脏肿瘤、肾脏肿瘤以及最新出现的脊骨肿瘤,且脊骨肿瘤出现的养殖场死亡率显着高于其他养殖场。随后,病毒分离和间接免疫荧光实验显示上述21家养殖场均存在ALV-J的感染,阳性率在20%-100%之间,总体阳性率约为60%,且发生脊骨肿瘤的山东养殖场阳性率均为100%。随后,本研究对所分离到的21株代表毒株进行了env基因测序与分析。同源性比较显示:本研究分离的病毒株核酸序列同源性为97.0%-99.9%,氨基酸序列同源性为94.7%-99.8%,说明这些病毒株高度相似,可能有共同的祖先。同时,本研究证实,此次我国多个省份肉种鸡养殖场中出现的ALV-J毒株与分离自黄羽肉鸡的GD14J2毒株（Genbank登录号:KU500032）的同源性最高,在95.77%～97.16%之间,明显高于其他参考毒株,说明这些新毒株与GD14J2的亲缘关系更为密切,但是否这些毒株具有相同的起源目前仍无定论。另一方面,遗传进化分析显示本研究在相同省份分离到的毒株不具有明显的地域性,且不同来源的毒株在env基因区段拥有一致的基因插入或缺失突变,这表明可能引发此次禽白血病爆发的ALV-J毒株可能存在多个传染源,并非直接来自同一毒株。同时,本研究也探讨分析了疫苗污染可能在此次ALV-J再次爆发中发挥的作用,但结果显示发生禽白血病的养殖场并未使用含有ALV-J外源病毒污染的疫苗,表明病毒可能来自其他途径。上述研究证实了引发此次禽白血病爆发的毒株属于ALV-J,探明了其分子特征和基因组变异情况,为临床防治该病提供了坚实的理论依据。
二、J亚群禽白血病病毒gp37基因的克隆和序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、J亚群禽白血病病毒gp37基因的克隆和序列分析（论文提纲范文）
（2）2株J亚群禽白血病病毒毒株的分离鉴定及全基因组序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 病鸡剖检及病毒分离鉴定 |
| 1.3 ALV全病毒DNA的制备 |
| 1.4 全病毒基因组 |
| 1.5 克隆测序 |
| 1.6 全基因组序列拼接及分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病鸡剖检 |
| 2.2 病毒的分离及鉴定 |
| 2.3 全病毒基因组序列PCR扩增 |
| 2.4 分离毒株基因组序列测定 |
| 2.5 分离株与现有毒株序列同源性分析 |
| 3 讨论 |
（3）鸡Viperin蛋白与ALV-J相互作用的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 ALV概述 |
| 1.1.2 ALV分子结构 |
| 1.1.3 ALV致病机理 |
| 1.1.4 ALV流行病学 |
| 1.1.5 ALV诊断和检测 |
| 1.1.6 ALV防控和净化 |
| 1.2 Viperin蛋白概述 |
| 1.2.1 Viperin的基本结构与生物学特性 |
| 1.2.2 Viperin的表达调控 |
| 1.2.3 Viperin在免疫反应中的作用 |
| 1.2.4 Viperin的抗病毒作用 |
| 1.2.5 病毒逃避Viperin的机制 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细胞和毒株 |
| 2.1.2 感受态细胞和质粒 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 主要试剂与耗材 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 Viperin荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.2.1.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.1.2 鸡外周血淋巴细胞分离 |
| 2.2.1.3 提取外周血淋巴细胞总RNA |
| 2.2.1.4 反转录反应扩增鸡Viperin基因 |
| 2.2.1.5 目的条带胶回收 |
| 2.2.1.6 胶回收产物与p MD18-T载体的连接 |
| 2.2.1.7 连接产物的转化与培养 |
| 2.2.1.8 阳性菌液鉴定与测序 |
| 2.2.1.9 重组质粒提取 |
| 2.2.1.10 荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 2.2.1.11 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.2.1.12 荧光定量PCR的敏感性和重复性检测 |
| 2.2.2 Viperin的原核表达与多抗制备 |
| 2.2.2.1 pMD-Viperin与pET-32a(+)的双酶切 |
| 2.2.2.2 目的片段与载体的连接 |
| 2.2.2.3 连接产物的转化 |
| 2.2.2.4 重组质粒的筛选、鉴定与提取 |
| 2.2.2.5 Viperin蛋白的原核表达 |
| 2.2.2.6 Viperin蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.2.7 表达产物的Western Blot分析 |
| 2.2.2.8 Viperin蛋白的浓度测定 |
| 2.2.2.9 Viperin蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 ALV-J感染对体外培养细胞和鸡体内Viperin表达的影响 |
| 2.2.3.1 CEF细胞的制备 |
| 2.2.3.2 ALV-J感染CEF细胞及样品的收集 |
| 2.2.3.3 SPF鸡各组织器官的收集及Viperin转录量检测 |
| 2.2.3.4 ALV-J感染SPF鸡及外周血淋巴细胞的收集 |
| 2.2.3.5 荧光定量PCR检测Viperin转录水平变化 |
| 2.2.4 Viperin过表达对ALV-J复制水平的影响 |
| 2.2.4.1 Viperin真核质粒的构建 |
| 2.2.4.2 Viperin真核表达质粒的转染 |
| 2.2.4.3 IFA验证pcDNA-Viperin的表达 |
| 2.2.4.4 Western Blot验证pcDNA-Viperin的表达 |
| 2.2.4.5 过表达Viperin对病毒复制影响的测定 |
| 2.2.5 干扰Viperin表达对ALV-J复制水平的影响 |
| 2.2.5.1 siRNA的设计与合成 |
| 2.2.5.2 siRNA干扰Viperin效果的测定 |
| 2.2.5.3 干扰Viperin表达对病毒复制水平的影响 |
| 2.2.6 Viperin发挥抗ALV-J功能结构域的筛选 |
| 2.2.6.1 Viperin各区域片段的扩增 |
| 2.2.6.2 Viperin各区域过表达质粒的构建 |
| 2.2.6.3 Viperin各区域过表达质粒效果验证 |
| 2.2.6.4 过表达Viperin各区域对ALV-J复制水平影响的测定 |
| 2.2.7 筛选与Viperin互作的ALV-J病毒蛋白 |
| 2.2.7.1 pEGFP-Viperin过表达质粒效果验证 |
| 2.2.7.2 ALV-J各编码蛋白表达质粒的构建 |
| 2.2.7.3 ALV-J各编码蛋白过表达质粒效果验证 |
| 2.2.7.4 激光共聚焦检测Viperin与 ALV-J编码蛋白的共定位 |
| 2.2.7.5 免疫共沉淀筛选互作蛋白 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Viperin荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.1.1 鸡源Viperin全长CDS的扩增结果 |
| 3.1.2 反应体系与条件优化 |
| 3.1.3 标准曲线的建立 |
| 3.1.4 敏感性检测结果 |
| 3.1.5 重复性检测结果 |
| 3.1.6 SPF鸡组织中Viperin表达量检测结果 |
| 3.2 Viperin的原核表达和多抗制备 |
| 3.2.1 Viperin原核表达质粒的构建结果 |
| 3.2.2 Viperin蛋白的诱导表达结果 |
| 3.2.3 Viperin蛋白的浓度测定结果 |
| 3.3 ALV-J感染对宿主Viperin表达的影响 |
| 3.3.1 ALV-J感染CEF细胞对Viperin表达水平的影响 |
| 3.3.2 ALV-J感染SPF鸡对Viperin表达水平的影响 |
| 3.4 诱导Viperin表达对ALV-J复制水平的影响 |
| 3.4.1 pcDNA-Viperin过表达质粒的构建结果 |
| 3.4.2 pcDNA-Viperin质粒转染效果验证结果 |
| 3.4.2.1 IFA验证pcDNA-Viperin的表达 |
| 3.4.2.2 Western Blot验证pcDNA-Viperin的表达 |
| 3.4.3 过表达Viperin对 ALV-J复制水平的影响 |
| 3.5 干扰Viperin表达对ALV-J复制水平的影响 |
| 3.5.1 si RNA干扰效果测定结果 |
| 3.5.2 si RNA干扰Viperin表达对ALV-J病毒复制水平的影响 |
| 3.6 Viperin功能结构域的筛选结果 |
| 3.6.1 Viperin各功能区域真核质粒的构建 |
| 3.6.1.1 Viperin各区域片段的获取 |
| 3.6.1.2 pEGFP-N、pEGFP-SAM、pEGFP-C、pEGFP-Viperin质粒双酶切验证 |
| 3.6.1.3 质粒转染效果 |
| 3.6.2 过表达N.SAM.C区域蛋白对ALV-J复制水平的影响 |
| 3.7 与Viperin互作ALV-J病毒蛋白的筛选结果 |
| 3.7.1 ALV-J各区域真核质粒的构建结果 |
| 3.7.1.1 ALV-J各区域目的片段的扩增结果 |
| 3.7.1.2 ALV-J各部分蛋白表达质粒双酶切鉴定 |
| 3.7.2 质粒转染效果 |
| 3.7.3 激光共聚焦检测Viperin与 p19 蛋白共定位现象 |
| 3.7.4 免疫共沉淀验证ALV p19 蛋白与Viperin蛋白互作 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽白血病 |
| 1.1.1 ALV病原学 |
| 1.1.2 ALV流行病学 |
| 1.1.3 ALV致病性 |
| 1.1.4 ALV防控现状与存在问题 |
| 1.2 K亚群禽白血病病毒(ALV-K) |
| 1.2.1 ALV-K的发现 |
| 1.2.2 ALV-K基因结构及特点 |
| 1.2.3 ALV-K致病性及危害 |
| 1.2.4 ALV-K在我国鸡群感染现状 |
| 1.3 ALV抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.1 ALV-A/B/J抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.2 ALV-K抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.3 ALV-K抗体检测ELISA存在的问题 |
| 1.4 ALV单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.1 ALV-A/B/J单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.2 ALV-K单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.3 ALV-K单克隆抗体研究存在的问题 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 病毒、细胞、抗体和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 2.2.2 K亚群gp85 蛋白原核表达体系的建立 |
| 2.2.3 间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 2.2.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 2.2.5 ALV-K gp85 蛋白的单克隆抗体制备 |
| 2.3 数据处理与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 3.1.1 基因序列分析 |
| 3.1.2 目的蛋白分析 |
| 3.2 ALV-K gp85 特异基因的原核表达 |
| 3.2.1 ALV-K gp85 特异基因克隆PCR产物的鉴定 |
| 3.2.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 gp85 特异性蛋白的制备及鉴定 |
| 3.3 ALV-K间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 3.3.1 间接ELISA条件的优化 |
| 3.3.2 特异性试验 |
| 3.3.3 敏感性试验 |
| 3.3.4 重复性试验 |
| 3.3.5 符合率试验 |
| 3.3.6 保存期试验 |
| 3.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 3.4.1 多克隆抗体效价测定 |
| 3.4.2 多克隆抗体的纯化及检测鉴定 |
| 3.4.3 多克隆抗体的识别检测 |
| 3.5 ALV-K gp85 蛋白的单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 ALV-K gp85 蛋白免疫小鼠效价测定 |
| 3.5.2 杂交瘤细胞融合观察 |
| 3.5.3 杂交瘤细胞抗体分泌鉴定 |
| 3.5.4 腹水制备鉴定及应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ALV-K gp85 重组蛋白的制备 |
| 4.2 ALV-K间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 4.3 ALV-K多克隆抗体的制备 |
| 4.4 ALV-K单克隆抗体的制备 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得学术成果 |
（5）松花粉多糖活性组分及其靶向纳米药物抗ALV-J活性研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 J亚群禽白血病病毒(ALV-J)研究进展 |
| 1.1 ALV-J流行病学特点 |
| 1.2 ALV的理化特征与基因结构特点 |
| 1.2.1 形态学特征 |
| 1.2.2 ALV的理化特性 |
| 1.2.3 ALV基因结构 |
| 1.3 ALV的复制 |
| 1.4 ALV-J的致瘤特点 |
| 1.5 ALV-J致病性及危害 |
| 1.6 ALV-J的检测和诊断 |
| 1.6.1 血清学检测 |
| 1.6.2 免疫荧光技术(IFA) |
| 1.6.3 免疫组化技术 |
| 1.6.4 病毒基因检测 |
| 1.7 ALV-J的防控 |
| 1.7.1 免疫接种 |
| 1.7.2 药物治疗 |
| 1.7.3 种群净化措施 |
| 2 松花粉概述 |
| 3 多糖 |
| 3.1 多糖提取方法 |
| 3.1.1 经典法 |
| 3.1.2 超声波法 |
| 3.1.3 酶法 |
| 3.1.4 其他方法 |
| 3.2 多糖分离纯化 |
| 3.2.1 分级沉淀 |
| 3.2.2 柱分离 |
| 3.2.3 膜分离 |
| 3.3 多糖的生理功能 |
| 3.3.1 抗肿瘤作用 |
| 3.3.2 免疫增强作用 |
| 3.3.3 抗病毒作用 |
| 3.3.4 其他功能 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 松花粉多糖抗ALV-J活性单体分离鉴定及构效关系研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与病毒 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 马尾松花粉粗多糖提取 |
| 2.1.1 花粉除脂 |
| 2.1.2 多糖提取纯化 |
| 2.1.3 苯酚-硫酸法测定多糖含量 |
| 2.2 单体多糖分离纯化 |
| 2.3 单体多糖活性体外评价 |
| 2.3.1 细胞复苏及培养 |
| 2.3.2 细胞毒性试验 |
| 2.3.3 体外抗病毒活性 |
| 2.3.3.1 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.3.3.2 ELISA法检测细胞上清p27 抗原 |
| 2.3.3.3 qPCR方法检测病毒拷贝量 |
| 2.4 多糖及单体组分表征 |
| 2.4.1 单体多糖分子量测定 |
| 2.4.2 单体多糖红外光谱表征 |
| 2.4.3 单体多糖单糖组成测定 |
| 2.4.4 单体多糖三螺旋结构测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 脱蛋白纯化表征 |
| 3.2 总多糖提取条件筛选 |
| 3.3 单体多糖的分离纯化 |
| 3.4 不同pH条件下单体多糖提取效率比较 |
| 3.5 细胞毒性试验 |
| 3.6 多糖组分体外抗病毒活性评价 |
| 3.6.1 多糖组分对p27 抗原表达的影响 |
| 3.6.2 qPCR方法检测多糖组分病毒拷贝量 |
| 3.7 单体多糖分子量及其分布 |
| 3.8 单体多糖红外光谱分析 |
| 3.9 单糖组成的测定 |
| 3.10 单糖组成相对含量 |
| 3.11 三螺旋结构的测定 |
| 3.12 NaOH处理PPP-2 抗病毒活性研究 |
| 4 讨论 |
| 第三章 松花粉多糖壳聚糖纳米药物制备及抗ALV-J活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒与动物 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 松花粉多糖壳聚糖纳米药物(CS-PPPs NPs)制备 |
| 2.1.1 壳聚糖空白纳米药物(CS NPs)制备 |
| 2.1.2 载药纳米药物(CS-PPPs NPs)制备 |
| 2.2 CS-PPPs NPs体外表征 |
| 2.2.1 透射电镜表征 |
| 2.2.2 粒径及分布表征 |
| 2.2.3 包封率测定 |
| 2.2.4 载药量测定 |
| 2.2.5 体外释放试验 |
| 2.3 CS-PPPs纳米药物体外评价 |
| 2.3.1 细胞毒性试验 |
| 2.3.2 细胞荧光标记试验 |
| 2.3.3 体外抗病毒活性试验 |
| 2.4 纳米药物体内评价 |
| 2.4.1 纳米药物体内代谢行为研究 |
| 2.4.2 ALV-J体内感染模型建立及分组 |
| 2.4.3 泄殖腔排毒监测 |
| 2.4.4 大体剖检 |
| 2.4.5 组织病理观察 |
| 2.4.6 mRNA水平检测血浆病毒载量 |
| 2.4.7 免疫器官指数 |
| 2.4.8 白细胞检测 |
| 2.4.9 外周血淋巴细胞转换率(LTR)测定 |
| 2.4.10 血清中IL-2和IFN-γ分泌量测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流出曲线图 |
| 3.2 制备工艺筛选 |
| 3.2.1 壳聚糖浓度筛选 |
| 3.2.2 TPP比例筛选 |
| 3.2.3 多糖占壳聚糖浓度筛选 |
| 3.3 体外释放试验 |
| 3.4 纳米药物体外评价 |
| 3.4.1 纳米药物细胞毒性试验 |
| 3.4.2 体外荧光标记 |
| 3.4.3 体外抗病毒活性试验 |
| 3.5 纳米药物体内试验 |
| 3.5.1 纳米药物体内代谢行为研究 |
| 3.5.2 临床症状 |
| 3.5.3 泄殖腔排毒监测 |
| 3.5.4 大体剖检 |
| 3.5.5 组织病理观察 |
| 3.5.6 纳米药物对ALV-J在鸡体复制的影响 |
| 3.5.7 免疫器官指数 |
| 3.5.8 白细胞检测 |
| 3.5.9 纳米药物对感染ALV-J鸡外周血淋巴细胞转换率测定 |
| 3.5.10 纳米药物对感染ALV-J鸡外周血中细胞因子浓度影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 基于抗体靶向的壳聚糖纳米药物递送系统增强松花粉多糖抗ALV-J活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒与动物 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 基于抗体靶向的松花粉多糖壳聚糖纳米药物(Ab-CS-PPPs NPs)制备 |
| 2.1.1 壳聚糖抗体(Ab-CS)复合物的制备 |
| 2.1.2 Ab-CS-PPPs NPs制备 |
| 2.2 Ab-CS-PPPs NPs理化表征 |
| 2.2.1 红外光谱表征 |
| 2.2.2 透射电镜(TEM)表征 |
| 2.2.3 粒径及分布表征 |
| 2.2.4 包封率及载药量测定 |
| 2.2.5 体外释放试验 |
| 2.3 Ab-CS-PPPs NPs体内外ALV-J靶向试验 |
| 2.3.1 Ab-CS-PPPs NPs细胞靶向研究 |
| 2.3.2 Ab-CS-PPPs NPs体内靶向组织分布研究 |
| 2.3.3 Ab-CS-PPPs NPs体内靶器官抑制ALV-J复制研究 |
| 2.4 Ab-CS-PPPs NPs毒理及代谢研究 |
| 2.4.1 细胞毒性研究 |
| 2.4.2 Ab-CS-PPPs NPs体内代谢研究 |
| 2.5 Ab-CS-PPPs NPs体内外抗病毒活性研究 |
| 2.5.1 Ab-CS-PPPs NPs体外抗病毒活性表征 |
| 2.5.2 ALV-J体内感染模型建立及分组 |
| 2.5.3 泄殖腔排毒监测 |
| 2.5.4 大体剖检及组织病理观察 |
| 2.5.5 血浆病毒载量检测 |
| 2.6 Ab-CS-PPPs NPs缓解ALV-J免疫抑制研究 |
| 2.6.1 免疫器官指数 |
| 2.6.2 白细胞及外周血淋巴细胞转换率(LTR)测定 |
| 2.6.3 血清中IL-2和IFN-γ分泌量测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Ab-CS-PPPs NPs理化表征 |
| 3.1.1 Ab-CS复合物制备及红外表征 |
| 3.1.2 Ab-CS-PPPs NPs粒径、包封率及载药量表征 |
| 3.1.3 Ab-CS-PPPs NPs形态及粒径表征 |
| 3.1.4 体外释放试验 |
| 3.2 Ab-CS-PPPs NPs体内外ALV-J靶向试验 |
| 3.2.1 Ab-CS-PPPs NPs细胞靶向研究 |
| 3.2.2 Ab-CS-PPPs NPs体内靶向组织分布研究 |
| 3.2.3 Ab-CS-PPPs NPs体内靶器官抑制ALV-J复制研究 |
| 3.3 Ab-CS-PPPs NPs毒理及代谢研究 |
| 3.3.1 Ab-CS-PPPs NPs细胞毒性试验 |
| 3.3.2 Ab-CS-PPPs NPs体内代谢行为研究 |
| 3.4 Ab-CS-PPPs NPs体内外抗病毒活性研究 |
| 3.4.1 体外抗病毒活性 |
| 3.4.2 临床症状 |
| 3.4.3 泄殖腔排毒监测 |
| 3.4.4 大体剖检 |
| 3.4.5 组织病理观察 |
| 3.4.6 血浆病毒载量 |
| 3.5 Ab-CS-PPPs NPs缓解ALV-J免疫抑制研究 |
| 3.5.1 免疫器官指数 |
| 3.5.2 白细胞检测 |
| 3.5.3 抗体纳米药物对感染ALV-J鸡外周血LTR测定 |
| 3.5.4 纳米药物对感染ALV-J鸡外周血中细胞因子浓度测定 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（6）J亚群禽白血病共感染检测、病毒分离鉴定及其抗性细胞系构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一篇 文献综述 禽白血病病毒概述 |
| 1.1 ALV-J的基本结构 |
| 1.2 ALV-J基因组特性 |
| 1.3 ALV的检测与诊断方法 |
| 1.4 ALV的鉴别诊断 |
| 1.5 ALV-J的增殖和培养 |
| 1.6 ALV-J的细胞受体 |
| 1.7 ALV-J亚群抗性细胞系研究进展 |
| 1.8 ALV-J的流行情况 |
| 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 鸡群肿瘤性病毒共感染检测及ALV-J的分离鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第二章 ALV-J Gp85受体结合区独特氨基酸缺失对病毒生物学特性的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第三章 抗ALV-J的DF-1细胞系的构建及其抗病毒效果评价 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学钱间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）ALV-J编码蛋白对cGAS-STING信号通路的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 禽白血病研究进展 |
| 2 禽白血病病原学特点 |
| 2.1 病毒和不同亚群分类 |
| 2.2 病毒的形态 |
| 2.3 病毒核酸及蛋白组成 |
| 3 病毒致病机理、症状及流行现状 |
| 3.1 致病机理 |
| 3.2 传播特点 |
| 3.3 临床症状 |
| 4 疾病诊断和防治措施 |
| 5 禽类天然免疫DNA识别受体研究进展 |
| 6 cGAS-STING信号通路 |
| 7 cGAS-STING信号通路与病原体之间的相互作用 |
| 7.1 病原体靶向cGAS逃避胞质DNA感应 |
| 7.2 病原体降解2'3’-cGAMP以阻止STING激活 |
| 7.3 STING信号复合体的形成 |
| 8 本研究的目的与意义 |
| 第2章 筛选调控cGAS-STING信号通路的ALV-J编码蛋白及对病毒复制的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 主要试剂及配置 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 ALV-J病毒的复苏与培养 |
| 2.2 ALV-J病毒滴度测定 |
| 2.3 病毒感染细胞后IFN-β表达与病毒增殖情况的时间依赖性变化 |
| 2.4 Real-time PCR检狈测 |
| 2.5 相关质粒构建 |
| 2.6 质粒转染 |
| 2.7 双荧光素酶报告系统 |
| 2.8 使用通路特异性激活剂验证p15的抑制效果 |
| 2.9 p15蛋白对cGAS-STING通路抑制效果的剂量依赖验证 |
| 2.10 在鸡巨噬细胞(HD11)中p15对cGAS-STING通路的抑制作用 |
| 2.11 Western Blot检测蛋白表达情况 |
| 2.12 p15蛋白对ALV-J复制的影响 |
| 2.13 结果数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 在DF-1细胞中建立DLR检测系统 |
| 3.2 ALV-J感染DF-1细胞中的IFN-β表达及启动子活性 |
| 3.3 ALV-J编码蛋白真核表达载体的构建 |
| 3.4 调控宿主cGAS-STING信号通路的ALV-J编码蛋白的筛选 |
| 3.5 ALV-J p15抑制cGAS-STING介导IFN-β表达效果验证 |
| 3.6 在HD11细胞中验证ALV-J p15对信号通路的作用效果 |
| 3.7 过表达p15促进ALV-J在DF-1细胞中的复制 |
| 4 讨论 |
| 第3章 ALV-J p15蛋白的生物学功能及作用机制初步研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和质粒 |
| 1.2 主要试剂及配制 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 ALV-p15的生物信息学及保守性分析 |
| 2.2 点突变 |
| 2.3 引物设计 |
| 2.4 感染性克隆的制备 |
| 2.5 重组质粒连接产物的转化 |
| 2.6 阳性克隆的挑选及鉴定 |
| 2.7 p15蛋白对LPS和poly (I:C)刺激信号通路的影响 |
| 2.8 点突变后对cGAS-STING介导的IFN-β生成的影响 |
| 2.9 感染性克隆生产病毒活性及增殖情况测定 |
| 2.10 p15蛋白影响cGAS-STING信号通路的作用机制研究 |
| 2.11 结果数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 p15的活性位点预测 |
| 3.2 突变p15感染性克隆的构建 |
| 3.3 突变片段的感染性克隆拯救病毒活性显着下降 |
| 3.4 点突变后p15对cGAS-STING介导生成IFN-β的抑制效果有所恢复 |
| 3.5 p15蛋白对LPS和poly (I:C)诱导IFN-β表达情况的影响 |
| 3.6 过表达p15蛋白对天然cGAS-STING信号通路中关键信号分子表达的影响 |
| 3.7 p15产生抑制效果的靶点可能在分子入核机制或影响核内基因的转录 |
| 3.8 p15能显着性下调通路下游关键分子IRF-7和NF-κB启动子活性和基因水平的表达 |
| 3.9 过表达p15蛋白能显着抑制IRF-7的入核 |
| 4 讨论 |
| 第4章 ALV-J p15慢病毒表达载体的构建及初步应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 慢病毒质粒的构建 |
| 2.3 慢病毒的包装和收集 |
| 2.4 慢病毒滴度测定 |
| 2.5 plvx-p15-Flag质粒的慢病毒感染及目的蛋白表达的鉴定 |
| 2.6 LPS或poly (I:C)刺激慢病毒感染的LMH细胞后IFN-β表达水平检测 |
| 2.7 实验结果分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 慢病毒骨架质粒的构建 |
| 3.2 慢病毒滴度测定结果 |
| 3.3 p15蛋白在293T细胞中的表达 |
| 3.4 p15蛋白在LMH细胞中的表达 |
| 3.5 慢病毒感染LMH细胞在LPS或poly (I:C)刺激下IFN-β表达情况 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）沂蒙草鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定及遗传变异分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 病毒分离 |
| 1.4 细胞培养物ELISA检测 |
| 1.5 PCR分型鉴定 |
| 1.6 ALV-J全基因组序列测定 |
| 1.7 序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞培养物ALV-p27抗原ELISA检测 |
| 2.2 阳性样品PCR检测 |
| 2.3 ALV-J分离株全基因组序列分析 |
| 2.4 分离株env基因序列分析 |
| 2.5 分离株3′UTR序列分析 |
| 2.6 分离株3′LTR序列分析 |
| 3 讨论 |
（9）江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 家禽免疫抑制病概述 |
| 1.1 鸡传染性贫血 |
| 1.2 马立克病 |
| 1.3 网状内皮组织增生症 |
| 1.4 禽白血病 |
| 1.5 我国家禽免疫抑制病病原感染现状 |
| 2 免疫抑制病病原检测方法的研究概况 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 血清学检测技术 |
| 2.3 分子生物学检测技术 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 毒株来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 样品DNA的提取 |
| 2.4 样品RNA的提取和反转录 |
| 2.5 样品PCR检测 |
| 2.6 数据整理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病原的PCR检测结果 |
| 3.2 感染类型分析 |
| 3.3 不同日龄鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.4 不同品种鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.5 江苏地区鸡2016-2019年免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.6 4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株来源 |
| 1.2 临床样品来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2 病毒核酸提取 |
| 2.3 荧光定量PCR质粒标准品的制备与鉴定 |
| 2.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.6 临床样品的检测和验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒测序鉴定结果 |
| 3.3 质粒标准品的制备 |
| 3.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.6 临床样品的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 发病鸡背景资料及流行病学调查 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测 |
| 2.2 MDV分离培养 |
| 2.3 REV和ALV分离培养 |
| 2.4 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.5 致病相关基因的PCR扩增、测序及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 发病鸡的组织病变 |
| 3.2 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3 REV和ALV分离结果 |
| 3.4 MDV分离结果 |
| 3.5 间接免疫荧光试验 |
| 3.6 致病相关基因的PCR扩增及序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 本文第二章120份临床病鸡样品的流行病学背景资料 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）2017-2019年我国部分省份白羽肉鸡ALV-J的分离鉴定及env序列分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 ALV的形态 |
| 1.1.2 ALV的物理化学性质 |
| 1.1.3 ALV基因组结构 |
| 1.1.4 ALV 分类 |
| 1.1.5 ALV的变异与重组 |
| 1.1.6 ALV的致病性 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.2.1 流行史 |
| 1.2.2 临床症状与病理变化 |
| 1.2.3 传染源 |
| 1.2.4 易感动物 |
| 1.2.5 传播途径 |
| 1.3 病毒的检测与诊断 |
| 1.3.1 病毒的分离鉴定 |
| 1.3.2 血清学检测 |
| 1.4 禽白血病的综合防控 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 主要分子生物学试剂与试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病鸡剖检 |
| 2.2.2 病理组织学检查 |
| 2.2.3 血浆样品采集 |
| 2.2.4 血浆样品的处理 |
| 2.2.5 DF-1细胞复苏与培养 |
| 2.2.6 血浆样品病毒分离鉴定 |
| 2.2.7 细胞上清ALV-p27 抗原ELISA检测方法 |
| 2.2.8 间接免疫荧光(IFA)试验 |
| 2.2.9 病毒RNA提取 |
| 2.2.10 病毒RNA的 RT-PCR |
| 2.2.11 扩增产物回收与纯化 |
| 2.2.12 PCR产物与T载体连接 |
| 2.2.13 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.14 连接产物转化 |
| 2.2.15 重组克隆细菌的筛选 |
| 2.2.16 质粒的提取 |
| 2.2.17 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.18 阳性克隆的测序与序列分析 |
| 2.2.19 疫苗中外源病毒污染的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 生产数据分析与剖检记录 |
| 3.2 临床症状 |
| 3.3 病理观察 |
| 3.4 病毒分离与P27检测结果 |
| 3.5 IFA实验结果 |
| 3.6 env基因测序 |
| 3.7 本研究分离株之间的同源性分析 |
| 3.8 本研究分离株与参考毒株序列同源性分析 |
| 3.9 遗传进化分析 |
| 3.10 基因序列分析 |
| 3.11 疫苗外源病毒检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 我国部分地区白羽肉鸡群ALV-J的流行病学调查 |
| 4.2 我国白羽肉鸡群中新发ALV-J基因组变异分析 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
四、J亚群禽白血病病毒gp37基因的克隆和序列分析（论文参考文献）
- [1]一株E亚群禽白血病病毒的分离鉴定及致病性分析[D]. 王萌. 东北农业大学, 2021
- [2]2株J亚群禽白血病病毒毒株的分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 郭雨欣,游广炬,李晓齐,高丽,郑世军,王永强. 中国兽医杂志, 2021(06)
- [3]鸡Viperin蛋白与ALV-J相互作用的研究[D]. 王静. 山东农业大学, 2021(01)
- [4]K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用[D]. 王呈呈. 山东农业大学, 2021
- [5]松花粉多糖活性组分及其靶向纳米药物抗ALV-J活性研究[D]. 崔文平. 山东农业大学, 2021
- [6]J亚群禽白血病共感染检测、病毒分离鉴定及其抗性细胞系构建[D]. 李露媛. 扬州大学, 2021
- [7]ALV-J编码蛋白对cGAS-STING信号通路的影响及其作用机制研究[D]. 沈逵. 扬州大学, 2021
- [8]沂蒙草鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定及遗传变异分析[J]. 牛建蕊,王静,王培坤,薛聪,韩照清,于洋,王媛,张兴林. 中国兽医杂志, 2021(02)
- [9]江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用[D]. 闫彩虹. 扬州大学, 2020(04)
- [10]2017-2019年我国部分省份白羽肉鸡ALV-J的分离鉴定及env序列分析[D]. 栾秀敏. 山东农业大学, 2020(02)