一、苏云金芽胞杆菌研究进展（论文文献综述）
石建伟[1]（2020）在《苏云金芽胞杆菌Cry6A和Cry5B蛋白杀线虫机制研究》文中研究表明植物寄生线虫（plant-parasitic nematodes）分布广泛,并且种类多、数量大,对农业生产造成了巨大的经济损失。目前,防治植物寄生线虫的手段很多,其中,生物防治具有高效、安全的特点,越来越受到人们的关注和重视。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）代表了一种重要的生防细菌,不仅可以防治昆虫类害虫,还可以防治植物寄生线虫和动物寄生线虫。Bt具有多种针对线虫的毒素和毒力因子,包括蛋白类和小分子类等;其中,受关注度最高的是杀虫晶体蛋白（Cry蛋白）,主要分为Cry5蛋白家族和Cry6蛋白家族。目前,关于Cry蛋白杀线虫机制的研究非常有限,主要包括以下进展:杀虫晶体蛋白Cry6A可以通过细胞坏死途径引起秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的死亡;杀虫晶体蛋白Cry5B可以结合秀丽隐杆线虫的糖脂受体,从而在线虫肠道细胞膜上形成孔洞,进而导致线虫死亡。关于Cry6A识别的受体和Cry5B的胞内杀线虫机制还没有报导,本研究主要围绕这两个Cry蛋白杀线虫机制的未知领域进行展开。由于营自由生活的秀丽隐杆线虫的遗传操作简单,同时其与植物寄生线虫具有较高同源性,对植物寄生线虫的研究具有较强的指导作用,因此本研究选择了秀丽隐杆线虫作为研究Cry蛋白的靶标线虫,分别对Cry6A和Cry5B的杀线虫机制进行了研究。主要内容和结果如下:1.发现秀丽隐杆线虫中GPI锚定蛋白RBT-1是Cry6A杀线虫过程中的功能受体。第一,RBT-1可以与Cry6A发生相互作用。由于已报导的Cry蛋白受体主要是GPI锚定蛋白,本研究把Cry6A受体的筛选范围选定在线虫的GPI锚定蛋白。通过亲和层析筛选秀丽隐杆线虫的GPI锚定蛋白,本研究发现一个与Cry6A相互作用的蛋白。经LC-MS/MS鉴定,该蛋白是编号为F35E12.10（本文中简称为RBT-1,Receptor for Bacillus thuringiensis Cry Toxin）的未知功能蛋白。RBT-1位于线虫肠道细胞膜脂筏,具有N端信号肽以及糖基化位点。Western杂交和ELISA的结果进一步证明RBT-1和Cry6A之间具有相互作用,其互作的解离常数约为21.5 n M。第二,RBT-1参与了Cry6A的杀虫过程。通过罗丹明标记Cry6A的示踪实验,证明RBT-1参与了Cry6A在线虫肠道细胞的内化过程,同时表明RBT-1可以介导Cry6A与线虫肠道细胞膜互作。通过碘化丙啶的示踪实验,本研究发现RBT-1参与了Cry6A在线虫肠道细胞的穿孔过程。线虫生测结果显示,rbt-1突变可以导致线虫对Cry6A产生抗性,表明RBT-1可以介导Cry6A的杀线虫活性。这些结果表明,RBT-1是Cry6A在杀线虫过程中的特异性受体,代表了一类新的Cry蛋白受体。2.线粒体是Cry5B杀线虫的细胞内靶标。目前,Cry5B在杀线虫过程中的受体已经鉴定出来,但Cry5B在杀线虫过程中是否引起以及如何引起胞内病变的研究还未见报导。本研究开展了Cry5B的胞内杀虫机制的研究,并通过细胞生物学、分子生物学和遗传学等手段,发现线粒体是Cry5B的重要杀虫靶标。第一,Cry5B作用于线虫后,可以抑制线虫线粒体呼吸链复合物I的活性,并进一步降低了线虫的线粒体膜电势;呼吸链活性抑制与膜电势下降都与Cry5B的杀线虫过程相关。第二,Cry5B可以减少活性氧（ROS）产生;线虫生测结果表明,ROS可以增强Cry5B的杀线虫活性。第三,Cry5B可以引起线粒体分裂,且该形态变化是由线粒体膜电势下降引起的;线粒体分裂也是Cry5B杀虫过程的一部分。第四,Cry5B引起的线粒体膜电势下降能够引起线粒体数量下降,线粒体数量下降也与Cry5B杀虫过程相关。第五,局部性的Cry5B穿孔活性可以对线虫引起系统性的破坏,代表了一种新的Cry蛋白致病效应。这些结果表明,Cry5B在杀线虫过程中会引起靶标害虫的胞内病变,而且线粒体是对Cry5B敏感的线虫细胞器,是Cry5B杀线虫的重要的胞内靶标。这些发现阐释了Cry蛋白的新杀虫机制。
宋海洋[2]（2019）在《苏云金芽胞杆菌在不同植物叶片分布差异的研究》文中研究指明农业害虫种类多且危害广、危害周期长,目前仍以化学防治为主,但长期的化学农药使用,带来了“3R”问题,造成了生态环境的破坏。生物农药由于其对人畜、坏境无危害,越来越被大家所接受。苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis,Bt）其可产生特异性杀虫蛋白,对多种农业害虫具有特异的杀虫活性。本研究从北京植物园和廊坊实验基地共采集样品118种（植物园109种,基地9种）,包含41个目,59个科,从中选取42个科（1512个样品）,通过植物叶片,来进行Bt菌株的分离。分离得到64株含有杀虫晶体的菌株,分离率为4.23%;42个科中共有25个科分离出Bt,分离率为59.5%。其中七叶树科分离得到6株Bt菌株,其次是禾本科和茄科各分离出5株,鼠李科、松科、木兰科、石蒜科、千屈菜科、蝶形花科、柿科各分离出3株,桑科、景天科、蔷薇科、胡桃科、杨柳科各分离出2株,红豆杉科、唇形科、木犀科、银杏科、梧桐科、锦葵科、香蒲科,各分离出1株菌株。说明Bt在不同科植物叶片中的分布是存在差异的。通过光学显微镜检测观察,分离Bt菌株的伴胞晶体呈现多种形态,主要以钝菱形、长菱形、方形为主;还存在不规则形、球形等其他的晶体类型,部分菌株还可以观察到多种晶体形态共存。采用PCR鉴定体系,利用10对通用引物,筛选出cry1、cry2、cry3、cry8、cry9和cry11六种基因型。其中,含有cry1类的菌株共检出48株,检出率最高,占75%。其次含cry2类基因22株,cry11类基因16株,cry9类12株,cry8类4株,cry3类3株。有些菌株仅含有单一的cry1或cry2或cry8基因,其它则呈现基因组合形式,如cry1+cry2型、cry2+cry8+cry11型等多种类型。新鲜叶片分离出36株,占总分离菌株的56.3%;老叶分离出28株,新叶片的分利率高于老叶片。从各个科的植物叶片分离出Bt多少来看,七叶树科分离最多,占总分离Bt菌的9.4%。利用SDS-PAGE方法,分析了 Bt分离株的Cry蛋白表达量,发现分子量在130 kDa、90 kDa、70 kDa、60 kDa的蛋白量最为丰富。通过胞晶混合物对小菜蛾生物活性测定发现,48株对小菜蛾幼虫有较好杀虫活性的菌株。其中154,289两个编号的菌株,在浓度为0.25 μg/mL时,对小菜蛾的校正死亡率达50%以上。本研究探索了不同科植物叶片、新老叶片,所分离到Bt菌株的规律,高毒力菌株的分布情况,为Bt菌株植物叶片分离提供了一定的指导意义。
杨文君[3]（2019）在《苏云金芽胞杆菌BMB171合成黑色素机制研究》文中研究表明黑色素在自然界广泛存在,微生物、动物、植物以及人类均可产生黑色素。研究表明,生物体合成的黑色素具有抗氧化、抗紫外辐射、结合重金属离子等许多重要的生理功能,可提高生物的生存能力及环境适应性。苏云金芽胞杆菌（Bt）是一种伴随着芽胞的产生形成晶体蛋白的革兰氏阳性细菌,世界上使用最广范的生物杀虫剂。然而,Bt形成的具有杀虫活性的伴胞晶体作为Bt制剂的主要活性成分在施用的过程中易受到环境如紫外线的影响而降低杀虫效果。研究者通过多种方法来提高Bt制剂的抗紫外能力,其中之一便是利用黑色素作为Bt的紫外防护剂来增加Bt杀虫剂的持效性。前人研究表明苏云金芽胞杆菌绝大部分菌株通过高温诱导可获得产黑色素表型。本室前期通过高温诱导传代培养,得到BMB171的高产黑色素突变株BMB181,试验证实其无需诱导便可在LB培养基、ICPM培养基和发酵培养基中产生黑色素,并保持了BMB171良好的转化特性和表达性能,而且生物检测结果也表明BMB181所产的黑色素具有保护晶体蛋白活性免受紫外线破坏的功能。然而,目前关于苏云金芽胞杆菌的产黑色素的确切机制不甚明了。解析苏云金芽胞杆菌黑色素的产生机制不仅能够增加我们对Bt的认知,更为构建具抗紫外线能力的Bt工程菌提供理论基础,对Bt制剂在农业生产过程中的应用都有很广泛的意义。自然界中的黑色素主要分类为真黑素和褐黑素和异黑色素,其中DHN黑色素,HPQ黑色素和脓黑色素属于异黑色素。目前,已报道了真黑素、DHN黑色素、HPQ黑色素和脓黑色素的生物合成途径。参与这些黑色素合成途径相关的基因是已知的。前期研究发现,编码酪氨酸酶的基因存在于BMB171基因组序列中,但突变菌株BMB181（BMB171的衍生物）在敲除编码酪氨酸酶的基因后仍产生黑色素。据此,我们推测Bt中存在与酪氨酸酶催化的黑色素合成途径不同的其他黑色素生成途径。本研究以高产黑色素菌株BMB181为主要研究对象,对苏云金芽胞杆菌生产黑色素合成机制开展了研究,主要工作及结果如下:1.苏云金芽胞杆菌可通过尿黑酸双加氧酶突变产生黑色素对苏云金芽胞杆菌BMB171基因组序列进行分析,发现其中存在这种由尿黑酸介导的酪氨酸代谢通路。在人体中这种由尿黑酸介导的酪氨酸代谢途径需要六种酶的共同作用。其中尿黑酸双加氧酶是催化尿黑酸开环反应的关键酶。当尿黑酸双加氧酶失活时,会导致尿黑酸的积累并氧化聚合形成脓黑色素,最终致使人患尿黑酸症。我们据此推测苏云金芽胞杆菌也可产生以尿黑酸为前体物的脓黑色素。利用温敏型质粒构建hmgA基因插入突变体BMB171ΔhmgA,发现突变株BMB171ΔhmgA与BMB181具有相同的产黑色素表型。高效液相结果表明,突变株BMB171ΔhmgA与BMB181在生长过程中均会产生尿黑酸的积累。DNA测序结果表明BMB181中的hmgA基因存在一个核苷酸的改变（815C→T）导致BMB181中尿黑酸双加氧酶一个氨基酸发生了错义突变（272G→E）。回补试验证实菌株BMB171中尿黑酸双加氧酶在菌株BMB181中表达后可以恢复Bt菌株的不产黑色素表型。对其他的产黑色素Bt菌株CT137及CT153的尿黑酸双加氧酶基因进行测序发现CT137 HmgA中氨基酸发生错义突变（G241D）,而CT153HmgA中由于其基因中一个核苷酸的插入导致发生终止突变。对CT137及CT153进行回补试验后,重组菌株不产黑色素。这些说明尿黑酸双加氧酶单点突变可导致苏云金芽胞杆菌产生黑色素。2.HmgA中的6个氨基酸残基发生单点突变时会导致黑色素的形成二级结构预测发现HmgA中氨基酸残基Gly272位于β19-β20 loop中,基于BMB181中的HmgA发生G272E突变导致黑色素产生的特点,随机选择了BMB171HmgA中14个位于β-βloop上或者位于β折叠末端的氨基酸残基构建丙氨酸扫描突变体（G89A、N116A、G119A、D120A、G128A、F136A、K219A、G241A、P245A、H261A、N300A、G323A、H334A及P336A）,通过回补试验研究这些突变体对黑色素产生的影响,结果发现有6种突变体（G128A、F136A、G241A、H261A、H334A及P336A）对黑色素的形成有影响。这说明这6种突变体会导致HmgA失活,使Bt产生黑色素。虽然通过多序列比对发现这14个位点在HmgA中高度保守,但是从结构与功能关系方面来说,位点G128、F136、G241、H334及P336更为保守。对NCBI数据库中公布了全基因组序列的40余株苏云金芽胞杆菌菌株进行分析,发现由尿黑酸介导的酪氨酸代谢通路的编码相关蛋白的基因（hmgA,hppD及fahA）在上述所有菌株中普遍存在。同时分析发现尿黑酸双加氧酶基因在70种不同血清型Bt菌株中存在。这说明苏云金芽胞杆菌具有通过突变尿黑酸双加氧酶产生以尿黑酸为前体物的黑色素的潜力。通过生物信息学方法分析了Bt尿黑酸双加氧酶的特点包括疏水性、保守结构域、进化树分析、氨基酸的多态性及HmgA的三维结构。我们发现HmgA为亲水性蛋白,属于Cupin-like超家族蛋白。三维结构显示HmgA由两个三聚体结合形成六聚体结构。活性中心金属离子Fe2+与3个氨基酸残基His298、Glu305及His334配位结合。氨基酸多态分析显示多态位点有19个（S23A、S54A、L56V、S71A、S80N、S83T、I87V、I93M、S105T、D110N、T138M、V169L、L199I、E213D、H227Y、A343G、Q384E、Q384D、Y387H、T388N）。然而,这些位点的不同对黑色素的产生与否并不产生影响,所有这些菌株均不产生黑色素。这说明Bt中的尿黑酸双加氧酶功能具有一定的保守性,以至于我们从自然界中分离到的Bt菌株绝大多数都不产黑色素。3.Bt中存在其他不同于pyomelanin的黑色素产生机制前期已报道Bt经高温酪氨酸诱导产生可黑色素,然而这种黑色素的产生机制不是很清楚,推测是在高温条件下通过酪氨酸酶催化酪氨酸产生的黑色素。然而酪氨酸酶基因在Bt菌株中并不多见,这说明Bt中可能存在其他与酪氨酸酶有相似活性的蛋白。分析苏云金芽胞杆菌BMB171中基因组序列的编码区发现其中存在具有多铜氧化酶结构域的Laccase-like蛋白。对该蛋白的三维结构及活性位点进行了相关的分析,其结构域中含有金属离子Zn2+结合活性位点,4个半胱氨酸残基Cys181,Cys182,Cys239及Cys242与Zn2+配位结合。基因组分析结果显示该基因广泛存在于苏云金芽胞杆菌中。将Laccase-like蛋白表达及纯化并进行活性检测,初步确定其具漆酶活性。该蛋白与黑色素的关系需进一步探索。另外通过筛选YBT-1518干扰突变体,我们发现三株突变体产生黑色素。这三株突变体被干扰的基因分别是YBT151807140（烯酰基-（酰基载体蛋白）还原酶（Fab））,YBT151821755（XRE（Xenobiotic Response Element）家族调控因子）和YBT151823810（位点特异性整合酶）。这些蛋白与黑色素的关系目前还没有报道。本研究以高产黑色素Bt菌株BMB181为研究重点,阐明了该种黑色素在Bt中的形成机理。这不仅丰富了对Bt黑色素形成机制多样性的认识,同时也为采用分子遗传学手段构建高产黑色素的基因工程菌提供理论基础。本研究为在HmgA中进行点突变构建抗紫外线的Bt菌株提供理论依据,也为研究人类导致尿黑酸尿症的基因提供了一个有意义的模型。
牛丽洋[4]（2019）在《小菜蛾先天免疫系统对苏云金芽胞杆菌的免疫应答机制探究》文中研究表明小菜蛾对十字花科蔬菜危害巨大,世界各国都花费了巨大的人力物力来进行小菜蛾的治理。由于其生活周期短、繁殖周期短、能适应多种环境条件、抗药性强,给田间防治工作造成了巨大的困难。苏云金芽胞杆菌作为一种生物杀虫剂得到了全球各地的广泛使用,其连续不断的施用导致越来越多的害虫对其产生了抗性。本研究以福建省农科院分离保存的高毒力Bt菌株FJAT-12和敏感系小菜蛾为研究材料,初步探索小菜蛾先天免疫系统尤其是酚氧化酶原激活系统对苏云金芽胞杆菌的应答反应机制。主要研究结果如下:转录组测序分析苏云金芽胞杆菌侵染的小菜蛾体内基因的表达水平变化,共筛选到973个差异表达基因,主要参与昆虫体内的蛋白质代谢、蛋白水解及蛋白质运输过程。筛选出部分与昆虫的免疫相关的基因,通过qPCR进行验证,结果表明,表达水平上调的基因所编码的蛋白包括:肽聚糖识别蛋白PGRPs,蛋白酶PSH,Toll受体,蛋白酶pelle等Toll通路相关元件;免疫信号通路产物抗菌肽lysozyme、gloverin、cecropin,免疫相关因子hemolin等;以及对PPO激活具有负调控作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpins。表达量下调的基因主要编码昆虫肠道水解蛋白质的胰蛋白酶、糜蛋白酶等消化酶,可减弱Bt杀虫毒素在昆虫中肠的活化。ELISA法检测小菜蛾在取食Bt和其杀虫蛋白Cry2Ab30后体内酚氧化酶PO含量变化,发现PO含量在两个处理组的小菜蛾体内均出现先上升后下降的趋势,在取食12h时含量最高。qPCR检测小菜蛾PAP3、PPO1、PPO2基因的表达水平,结果显示PAP3表达量上升,ppO1、PPO2表达量下降。为进一步研究小菜蛾酚氧化酶原级联激活系统的作用机制,我们克隆了小菜蛾酚氧化酶原激活酶PAP3基因和小菜蛾酚氧化酶原PPO1和PPO2基因并进行生物信息学分析。结果显示PAP3基因全长1260bp,编码417个氨基酸,预测蛋白分子量为45.7kDa,等电点为5.95。其氨基端含有发夹结构域,羧基端含有催化活性结构域,属于clip-domain丝氨酸蛋白酶家族;PPO1基因全长2049bp,编码682个氨基酸,预测蛋白分子量为78.5kDa,等电点为6.33;PP02基因全长2091bp,编码696个氨基酸,预测蛋白分子量为79.8kDa,等电点为6.34;两个酚氧化酶原基因都含有两个铜结合位点,每一个铜结合区域都含有3个保守的组氨酸（His）残基。本论文成功地构建出三个基因的原核表达质粒,为后期对酚氧化酶原的活化机制及酚氧化酶抑制剂的研究打下基础。本研究主要通过转录组测序及分子克隆的方法初步分析了小菜蛾先天免疫系统对革兰氏阳性细菌Bt的应答反应,为小菜蛾先天免疫系统的进一步探索和新型害虫抑制剂的开发提供参考。
马佳,李颖,胡栋,彭杰丽,贾楠,张翠绵,王旭,王占武[5]（2018）在《芽胞杆菌生物防治作用机理与应用研究进展》文中指出芽胞杆菌Bacillus spp.是国际上应用非常普遍的生防细菌,一直是当今土壤微生物学和微生态学研究热点之一。目前,国内外已完成多个芽胞杆菌菌株全基因组测序分析工作。本文从芽胞杆菌的次生代谢与抑菌作用、生物膜与竞争作用、植物-芽胞杆菌-病原菌互作与诱导植物抗性三方面概括性地综述了芽胞杆菌的生防机制。通过芽胞杆菌功能拓展的分子改良,可以提高植物抗病性,并就生防芽胞杆菌剂的商业化生产及在农业上的应用作了探讨。近年来我国学者在芽胞杆菌应用基础研究上取得了丰硕成果,为进一步实现芽胞杆菌的产业化及其应用奠定了坚实的基础。
付成林[6]（2018）在《贵州地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证》文中研究指明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）自从被发现至今已被广泛的应用于农业生产、森林保护、园林防治以及卫生害虫的防治。目前,越来越多的Bt制剂和Bt作物得到了广泛的开发和应用,在防治害虫方面取得了良好的防治效果。自20世纪20年代以来,Bt蛋白就已经用于农业害虫的防治,并取得了上佳的效果。因此,分离筛选高效、广谱杀虫活性的Bt菌株,克隆新的杀虫活性基因,为生产实践防病治虫提供新的资源。本研究通过广泛采取收集贵州地区土壤腐殖质,以此分离筛选了一批Bt菌株,并对其进行基因型鉴定、杀虫活性分析,得到一批鳞翅目害虫具有杀虫活性的Bt菌株,并从CS137-2和CS72-1两个菌株中克隆得到3个新的Bt基因。对贵州多个地区共收集1170份样品进行芽胞杆菌抗生素分离处理,总共获得976株芽胞杆菌,鉴定出181株Bt菌,平均分离率超过了18%。对得到这的一百多株Bt菌进行基因型分析,发现其中含cry1、cry2、cry4、cry8、cry9、cry20、cry22、cry28、cry30、cry31、cry37、cry40、cry46、cry52和cyt2共计15种基因型,有87株未鉴定出基因型。菌株中有31种不同的基因型组合,杀鳞翅目害虫的基因型组合菌株最多,此外,杀同翅目/鳞翅目和杀鞘翅目/双翅目的基因型组合菌株也均有发现。多数Bt菌株的表达蛋白在SDS-PAGE分析下呈多条带,以标准蛋白Marker为参照可知其主要表达30-130KDa大小的蛋白;显微镜观察也发现多种晶体类型,且多数同一菌株中包含两种晶体形态。Bt菌所产生的伴胞晶体形状有球形、大小菱形、方形、米粒形等。生物测定结果表明,其中有101株Bt菌对棉铃虫具有活性,另外有80株菌对棉铃虫无杀虫活性。表明,该地区的Bt资源丰富,基因类型丰富多样,杀虫谱广,具有良好的多样性。本研究从菌株中选择了基因类型丰富,杀虫活性高的菌株CS72-2和CS137-2作进一步研究。研究通过对CS72-2和CS137-2菌株进行全基因组测序并组装,根据测序组装结果设计引物对两个菌株进行PCR-RLFP克隆和PCR直接克隆,共克隆得到3个新基因,其中包含1个第二等级基因、1个第三等级基因和1个第四等级基因。分别命名为cry28-like、cry37-like、cyt2-like。将基因cry28-like构建穿梭表达载体pSTK后转入无晶体突变株HD73-能产生菱形晶体。其对亚洲玉米螟和棉铃虫有杀虫活性,但对秀丽隐杆线虫和番茄根结线虫的无杀虫效果。对基因cry37-like和cyt2-like两个杀虫基因进行功能验证,生物活性测定表明两类诱导表达蛋白对两种鳞翅目昆虫具有杀虫活性,cry37-like和cyt2-like诱导表达蛋白对亚洲玉米螟和棉铃虫具有杀虫活性。cry37-like的诱导表达蛋白对秀丽隐杆线虫的杀虫活性相对较低,而对番茄根结线虫不具有杀虫活性。cyt2-like的诱导表达蛋白对秀丽隐杆线虫和番茄根结线虫的杀虫效果均较弱,72h后校正死亡率分别为35%和与30%。
王海文[7]（2017）在《dlt操纵子在苏云金芽胞杆菌与昆虫相互作用中的功能研究》文中研究指明大多数革兰氏阳性病原细菌如炭疽芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等都存在dlt操纵子,其功能是使细胞壁的磷壁酸发生D-丙氨酰化修饰,从而使细胞壁表面带正电荷,导致对宿主阳离子抗菌肽（AMPs）的抵抗力增强,逃避宿主免疫反应,这是病原微生物在与宿主相互作用过程中进化出的一种有效保护机制。苏云金芽胞杆菌（简称Bt）是昆虫及线虫的一种革兰氏阳性病原细菌,分析其基因组发现也有dlt操纵子的存在。Bt作为一种杀虫微生物,以杀虫晶体蛋白为其主要杀虫活性成分,在其与昆虫宿主相互作用过程中,病原和宿主都会进化出各种保护机制,从而提高其在自然界中的生存能力,dlt操纵子极有可能是Bt逃避昆虫宿主免疫反应的一种有效方式。因此,本研究通过敲除Bt菌株中dlt操纵子,分析其对Bt自身生长繁殖等基础生物学方面的影响,并探讨其在与昆虫宿主相互作用过程中的生物学功能。本研究利用同源重组技术敲除Bt无晶体突变株BMB171中dltA基因,成功构建了dltA基因缺失突变株,同时构建了互补株和空载体菌株。表面电荷差异分析表明dl 操纵子功能缺失可引起菌体细胞表面净负电荷显着增加,验证了其在Bt中具有调控细胞表面电荷的功能。形态学观察表明其功能缺失可导致生物量明显减少且产芽胞时间推迟,但对菌体形态无明显影响,这说明dlt操纵子可影响细胞的生长和繁殖,并间接调控伴胞晶体的产生。进一步研究发现突变株对AMPs的敏感性显着增强,表明dlt操纵子能增强Bt对AMPs的抵抗,有利于逃避昆虫免疫反应。抗逆性分析表明dlt操纵子不改变细胞对温度的耐受性,但其功能缺失可增强酸耐受性,导致碱耐受性减弱,表明其可通过改变pH耐受性延长在虫体肠道内的存活时间,辅助增强杀虫毒力。细胞实验则表明该操纵子能通过减弱昆虫中肠细胞对Bt的黏附来逃避昆虫免疫防御。综上所述,本研究结果表明dlt操纵子在Bt与昆虫相互作用中具有重要作用,是Bt抵御昆虫宿主免疫反应的一种有效保护机制。本研究结果有助于从生态学的角度理解dlt操纵子对于Bt在自然界中生存的重要意义,并为提高其对昆虫宿主的感染能力以及应对昆虫抗性的产生提供新的策略。
蒋春号[8]（2016）在《蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物对丁香假单胞菌及南方根结线虫抗性机理研究》文中指出蜡质芽胞杆菌AR156（缩写为Bc AR156）是本实验室前期从森林树木根围土壤中分离的一株植物根围促生细菌（PGPR）,可广谱性防治茄劳尔氏菌引起的蔬菜青枯病、辣椒疫霉引起的疫病、尖孢镰刀菌引起的枯萎病和南方根结线虫引起的根结线虫病。目前该菌株已经获得相关专利,完成全基因组解析,获得防治番茄根结线虫病害的生物农药正式登记证。前期研究发现Bc AR156能够诱导拟南芥产生对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonassyringae pv.tomato,以下简称Pst）DC3000系统抗性;机理研究表明,Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性是通过同时激活水杨酸以及茉莉酸/乙烯两条信号通路,同时具有NPR1依赖性。为什么Bc AR156能同时激活拟南芥体内这两条信号通路,而其他生防因子如荧光假单胞菌、部分芽胞杆菌只能激活其中的某一条信号途径?Bc AR156如何被植物体识别,从而激活植物体的系统抗性?在Bc AR156诱导抗性过程中植物内源small RNA的调控作用是什么?除了上述广谱抗病机理外,既然根结线虫与其他病原物的致病机理完全不同,Bc AR156又是如何高效特异性地防治蔬菜根结线虫病害的?这些关于Bc AR156的生防机理问题的解决,将能更有效地推广使用生物农药活菌制剂,推动微生物农药产业的发展。本研究以Bc AR156为生防菌,以拟南芥、番茄为模式植物,以Pst DC3000、南方根结线虫为模式病原,进行三者互作研究,探究生防菌防病机理。本研究首先从转录因子角度出发,清楚地解析了 Bc AR156诱导抗病性机理,最终筛选发现Bc AR156分泌的胞外多糖（EPS）能够作为一种微生物相关分子模式（MAMPs）,被植物体表面模式识别受体识别,进而激活植物体自身防卫反应;同时发现植物内源miRNA:miR472和miR825/825*也参与调控Bc AR156诱导系统抗性过程。针对根结线虫的特异性生防机理研究发现,Bc AR156一方面能够改变番茄根系结构,促进番茄根系的快速成熟,从而降低根结线虫对番茄根系的侵染概率;另一方面Bc AR156还能抑制根结线虫某些效应因子编码基因的表达,降低其对番茄的致病力,最终达到高效防治番茄根结线虫的效果。1.转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导系统抗性过程中的作用机理研究以拟南芥为模式植物探寻转录因子WRKY70和WRKY11在Bc AR156诱导系统抗性过程中所起作用。结果表明,Bc AR156处理拟南芥后,能够显着提升植物体内转录因子WRKY70的表达量,同时显着抑制WRKY11的表达。研究还发现转录因子WRKY70和WRKY11为Bc AR156诱导细胞防卫反应以及防卫相关基因的表达所必须。过量表达转录因子WRKY70和WRKY11能够影响Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的抗性。突变体验证结果显示:Bc AR156诱导抗性的能力在转录因子WRKY70和WRKY11单突变体拟南芥植株中能够保留,但抗性能力略微下降,然而在WRKY70和WRKY11双突变体植株中则完全丧失。以上结果表明,转录因子WRKY70和WRKY11是通过两条不同途径调控Bc AR156诱导系统抗性的,并且这两条途径之间具有协调作用。转录因子WRKY70和WRKY11靶标分析结果表明:WRKY70通过水杨酸信号通路,WRKY11通过茉莉酸信号通路来调控Bc AR156诱导的系统抗性,而且这两条调控通路之间具有NPR1的依赖性。综合上述结果,发现转录因子WRKY70和WRKY11在调控Bc AR156诱导系统抗性过程中起着重要的作用。本研究也是首次从转录因子角度出发,阐明根围有益微生物如何同时激活水杨酸、茉莉酸/乙烯两条信号通路,来诱导寄主植物对病原菌的抗性。2.蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖作为一类MAMPs激活植物系统免疫在诱导系统抗性过程中,植物体对Bc AR156的早期识别起着重要作用。本研究结果表明,Bc AR156分泌的胞外多糖能够诱导拟南芥产生对Pst DC3000的系统抗性;在此过程中,能够提升防卫相关基因PR1、PR2、PR5以及MAPK激酶MPK6的上调表达;另外,也能够激活植物体细胞防卫反应如活性氧爆发、胼胝质沉积以及防卫相关酶活性的提升。基因上位性分析结果显示,Bc AR156胞外多糖仍能够在信号通路突变体jar1、etr1中诱导对Pst DC3000的系统抗性,与野生型Col-0相比,其在突变体jar1、etr1中诱导抗性能力略有降低;在NahG转基因植物以及npr1突变体中,Bc AR156胞外多糖的诱导抗性能力丧失。以上结果表明,Bc AR156胞外多糖诱导的系统抗性依赖MAMPs信号识别和水杨酸信号通路转导,并且具有NPR1依赖性。综上所述,Bc AR156胞外多糖在Bc AR156诱导系统抗性过程中,作为一类MAMPs,发挥着重要的作用。3.Sma11 RNAs在生防菌诱导植物抗病中的调节作用为研究植物内源small RNA在调控植物诱导抗性的机理,本研究利用deep sequencing以及生物信息学技术,筛选获得一些参与调控植物诱导抗性的miRNA。Northern Blot验证试验结果显示,在Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的抗性过程中,miR472,miR825和miR825*三种miRNA在Bc AR156处理的拟南芥叶片内被显着下调。对上述miRNA靶标预测结果显示,miR472,miR825和miR825*的靶标主要参与植物基础免疫,其中miR825靶标主要一些泛素蛋白连接酶;miR472和miR825*的靶标主要是一些参与ETI途径的R基因。研究发现上述预测的靶基因的表达受到miRNA负向调控。另外,miRNA缺失突变体表现出对病原细菌Pst DC3000的抗性。与此相反,miRNA过表达转基因植株对病原菌更敏感。综上所述,BcAR156通过抑制miR472、miR825和miR825*三种miRNA的表达,引起其靶标基因的上调,从而激活植物体自身的防卫反应,诱使植物产生系统抗性。4.蜡质芽胞杆菌AR156调控植物根系发育防治根结线虫病害的机理研究本研究发现,Bc AR156处理番茄根系能够诱导其结构变化;加速根系的成熟化（如根毛增多,根毛区比例显着增加）,从而降低根结线虫进入植物体内的概率;减少植物根系内根结线虫的虫口数,从而获得防治根结线虫的效果。为探究Bc AR156防治根结线虫的机理,我们从植物根系结构发育角度出发,利用转录组学分析技术,探究Bc AR156改变植物根系结构防治根结线虫的分子机理。转录组结果显示,Bc AR156能够引起植物体内一系列与发育相关基因的表达,其中最为显着的是与脱落酸、乙烯、热激蛋白相关的基因,定量PCR验证结果与预测结果相同。综上所述,Bc AR156能够调控一些与脱落酸、乙烯、热激蛋白相关的基因,来调控植物根系的发育;加速根系的成熟化,进而诱导植物抵抗根结线虫的侵染。5.蜡质芽胞杆菌AR156调控根结线虫效应因子表达防治病害的机理研究研究发现利用Bc AR156预处理植物后接种根结线虫,能够显着降低线虫的侵染,为深入探究其生防机理,本研究利用转录组学分析技术进行研究。结果显示,Bc AR156处理能够抑制根结线虫效应因子编码基因的下调表达;Q-RT-PCR验证发现有11个效应因子的表达受到Bc AR156的抑制。本研究首次发现,生防菌能够通过抑制根结线虫效应因子的表达而降低根结线虫的致病力,以达到防治目的。
黄刚辉[9]（2016）在《高海拔地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证》文中研究表明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）为一种革兰氏阳性细菌,它在芽胞形成期能够产生一种或者多种由基因cry/cyt编码的杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs）。近年来国内很多学者从不同省份不同地域的土壤中相继分离到高毒力的Bt的新菌株。但是针对高海拔地区不同生态环境的Bt资源报道鲜少。四川西部地面海拔高度为2500-4500米的高海拔地区,包括有原始森林、草原、湿地、冰川等不同的生态环境,气候区域表现差异显着。本实验立足于四川西部高海拔地区,对其不同生态环境中Bt资源分布以及筛选新型杀虫基因进行研究,结果如下:1、从四川西部高海拔地区不同的生态区采集的912份土样中,共分离出351株苏云金芽胞杆菌,利用光学显微镜从中初步鉴定出161株产晶体Bt菌,平均分离率为38.49%（Bt菌占所有芽胞杆菌的比率）和产晶体的Bt分离率为17.65%。这161株Bt菌所产生的伴胞晶体形状有大（小）菱形、方形、米粒形、大（小）球形、不规则形等。随着海拔高度的增加,Bt分离率开始下降;原始森林的Bt分离率高于雪山与草地的分离率。这充分显示了川西高海拔地区不同生态区Bt资源的多样性。2、采用PCR-RFLP鉴定方法对161株产晶体菌株进行了cry 基因的鉴定分析,发现cry1、cry1、cry2、cry4、cry5、cry6、cry9、cry12、cry14、cry15、cry18、cry28、cry30、cry54、cry57等15种基因型。cry1类基因型最多,占50%;其次是cry16类46.36%,cry9类 30.9%,cry1I类 29.09%,cry15类 27.27%,cry30 类 21.81%,cry4类17.27%,而其他种类的基因型偏少。3、对产晶体的Bt菌株进行蛋白电泳分析,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）结果显示这些基因主要表达30-130KDa大小的蛋白。161株产晶体菌株分别对玉米螟、甜菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾、小地老虎和秀丽隐杆线虫进行生物活性测定。其中18.6%的菌株对小菜蛾具有杀虫活性:19.87%的菌株对棉铃虫具有杀虫活性;31.7%的菌株对甜菜夜蛾具有杀虫活性;13%的菌株对小地老虎具有杀虫活性;17.39%的菌株对玉米螟具有杀虫活性;17.4%的菌株对秀丽隐杆线虫具有杀虫活性。分析发现,产菱形与方形晶体的Bt菌株对鳞翅目害虫的杀虫效果最佳,其次是产米粒形晶体的Bt菌株,部分球形晶体菌株对棉铃虫和甜菜夜蛾有杀虫效果,但半致死浓度（LC50）较高。4、从161株菌株中选择了 1株对秀丽隐杆线虫作用较好的产菱形晶体菌株和2株对鳞翅目具有杀虫活性的产球形晶体菌株进行下一步研究。通过全基因组测序,得到了 4个与已知基因同源性较低的片段,通过简并引物方法,聚合酶链反应（PCR）克隆得到了这 4 个新基因,分别为cry32Y-like、cry32X-like、cry9H-like、cry72A-like,与已知基因cry32Hb1、cry32Sa1、cry9Ha4以及cry72Aa1的同源性分别为55%、45%、48%、95%。cry32Y-like、cry32X-like 与cry9H-like均为第二级基因,cry72A-like为第四级基因。cry32Y-like全长为4107bp,将其插入穿梭表达载体pSTK获得重组质粒pSTK-32Y,去甲基化后转入无晶体突变株HD73-,产生球形晶体。cry32X-like、cry9H-like、cry72A-like 全长分别为 1896bp、2096bp 与 2127bp,将其插入原核表达载体pET-28a获得重组质粒pET-32X、pET-9H与pET-72A,重组质粒再转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG低温诱导成功表达蛋白。表达蛋白分别对玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾、秀丽隐杆线虫、番茄根结线虫进行生物活性测定。结果显示:Cry32Y-like对秀丽隐杆线虫与番茄根结线虫的杀虫活性较好,72h后校正死亡率分别为72%与64%,LC50分别为803μg/mL与920μg/mL。Cry32X-like表达产物对甜菜夜蛾、秀丽隐杆线虫与番茄根结线虫的杀虫效果较好,校正死亡率分别为65%、76%与 70%,LC50 分别为 710μg//mL、421μg/mL 与 603μg/mL。Cry9H-like 表达产物对棉铃虫有一定的杀虫活性,7d后校正死亡率为45%,抑制生长率为55%。Cry72A-like表达产物对甜菜夜蛾具有极高的杀虫活性,7d后校正死亡率为95%,LC50 为 961μg/mL。5、cry71Aa1与cry72Aa1为第一级新基因,将其插入穿梭表达载体pSTK获得重组质粒pSTK-71A与pSTK-72A,去甲基化后转入无晶体突变株HD73-,均产生球形晶体。表达蛋白活性测定结果显示,Cry71Aa1与Cry72Aa1对番茄根结线虫表现出一定的作用效果,72h后校正死亡率分别为76%与53%,LC50分别为542μg/mL与872μg/mL。6、已知基因表达蛋白对线虫的杀虫活性验证结果发现,Cry1Hc1与Cry1Aj1对秀丽隐杆线虫的杀虫效果较好,72h校正死亡率达到84%、82%。以上这些基因分别对鳞翅目昆虫与线虫表现出了杀虫活性,这不仅丰富了杀虫新基因的种类,也为新基因杀虫谱提供一定的实验依据。
刘瑶[10]（2016）在《云南地区苏云金芽胞杆菌的分离鉴定和对几种鳞翅目害虫生长发育的影响》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）被广泛的应用于农业、园艺、森林、储藏类害虫的防治。目前越来越多的Bt生物杀虫剂和转Bt作物被广泛的开发和应用,在有害昆虫的防治过程中取得了良好的防治效果。目前,世界许多国家都在研究延缓昆虫抗性产生的有效办法,其首要工作是分离并挖掘新的具有广谱杀虫性的Bt杀虫晶体蛋白。另外长期单一的使用一种杀虫毒素,使得有害昆虫的抗性逐渐产生,次要害虫也逐渐变成主要害虫,对害虫的防治造成了很大的困扰。本研究对云南地区不同生态地区进行Bt资源的分离,并鉴定基因型和分析生物活性,并选择了五个菌株来研究其对玉米螟、甜菜夜蛾、棉铃虫三种鳞翅目害虫的生长发育的影响。具体结论如下:1、菌株的分离鉴定、基因型分析和生物测定:本次研究从云南不同生态区共采集土样1487份,得到菌株1741株,利用光学显微镜从中鉴定出406株Bt菌,平均分离率达到20%以上。利用PCR-RFLP法来鉴定此次分离出的Bt菌株,发现了 18 种基因型,分别是 cry1、cry2、cry11、cry4、cry6、cry7、cry9、cry15、cry20、cry26、cry28、cry30、cry40、cry54、cry56、cry73、cyt2 和 vip3,其中 cry1和cry2基因型最多,达到了 65%以上;其次是cry4、cry28、cry30的基因型相对含量较多,而cry9类基因型相对偏少。通过对这些基因型的鉴定,我们还发现杀鳞翅目害虫的基因型（cry1A、cry2A）偏多,杀双翅目害虫的基因型（cry4B、cry20A）偏少,还有部分杀线虫（cry6A）和鞘翅目（cry7A）的基因型。选择部分有代表性的菌株进行SDS-PAGE蛋白电泳分析,发现这些菌株主要表达条带大小为130kDa、90kDa、75kDa、66kDa、55kDa、35kDa、30kDa 和 15kDa。这也表明分离到的Bt菌株基因类型极为丰富。此外我们还对这些菌株进行生物活性测定,发现这些菌株具有较广的杀虫活性,对鳞翅目害虫有良好的作用效果。2、玉米螟取食含Bt菌蛋白的半人工饲料对其生长发育的影响:本研究从菌株中选择了对玉米螟具有阻碍生长作用的LJ76-2、LJ86-1、DL80-1、KM54-1和DQ62-1五株产生球状晶体的菌株进一步研究。采用PCR-RFLP和SDS-PAGE分析鉴定发现这些菌株具有多种基因型且表达多种蛋白条带,表明可能含有新的基因型。我们用含不同Bt菌蛋白的半人工饲料对玉米螟幼虫喂食,结果发现:这五个菌株蛋白对玉米螟的生长发育具有不同程度的阻碍作用,主要表现为幼虫的平均体长变短、平均存活率较低、化蛹个数偏少、虫态历期增长等方面,但能够成功化蛹的玉米螟大多数都能成功羽化。因此本研究通过对玉米螟幼虫分别喂食含不同Bt菌蛋白的半人工饲料证实了这几株Bt菌对玉米螟的生长发育在不同程度上有一定的阻碍作用。3、甜菜夜蛾取食含Bt菌蛋白的半人工饲料对其生长发育的影响:本研究将制好的含菌半人工饲料用来喂食甜菜夜蛾幼虫并观察其生长发育情况,分析数据表明,这几种菌对甜菜夜蛾的作用效果同对照组相比有不同的差异性。DQ62-1这个菌株对甜菜夜蛾的作用效果初始与对照组差异不大,后期逐步出现差异性,发育完整性也较其他组晚;对甜菜夜蛾作用效果最好的是LJ76-2和DL80-1这两组,第七天时无论是平均虫体长度还是存活率都要明显的差别于对照组,并且还与其他组的作用效果有所差异,此外,这两组的化蛹率也最低。因此,通过这一系列的实验结果发现,LJ76-2和DL80-1这两株菌具有较好的实际应用价值。4、棉铃虫取食含Bt菌蛋白的半人工饲料对其生长发育的影响:本实验还研究了含不同Bt菌蛋白的半人工饲料对棉铃虫幼虫的生长发育情况,发现棉铃虫在不同的生长发育时间其平均存活率是逐步降低的,在半人工饲料中添加的不同的苏云金芽胞杆菌蛋白均使棉铃虫的生长发育受到影响。通过显着性分析情况来看,各个实验组除了 LJ86-1与其他实验组有差异外,其余实验组之间的差异性都不明显。在观察幼虫生长发育时我们还发现初始时期棉铃虫幼虫出现拒食现象,幼虫体长变化不明显,部分幼虫在适应Bt毒素的作用效果后,通过调节自身的生理代谢机制,继续进行生长发育,部分未能成功调节的幼虫则逐步死亡。综上所述,云南地区不仅具有丰富的Bt资源,且有多种多样的类型。因此开展Bt菌株的深入挖掘工作具有重要的意义。通过研究我们选择的五个菌株对鳞翅目害虫的生长发育的作用研究,其结果可以用于Bt蛋白对有害昆虫作用的参考,还可为有害昆虫的防治和转基因作物的生物效果研究提供新的数据支持。
二、苏云金芽胞杆菌研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、苏云金芽胞杆菌研究进展（论文提纲范文）
（1）苏云金芽胞杆菌Cry6A和Cry5B蛋白杀线虫机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表Abbreviation |
| 1 前言 |
| 1.1 植物寄生线虫 |
| 1.1.1 植物寄生线虫的危害 |
| 1.1.2 植物寄生线虫的防治 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌Cry蛋白研究进展 |
| 1.2.1 苏云金芽胞杆菌杀虫活性物质简介 |
| 1.2.2 BtCry蛋白简介 |
| 1.2.3 Cry蛋白作用方式 |
| 1.2.4 BtCry蛋白的抗性和解决策略 |
| 1.3 杀线虫Bt的研究概况 |
| 1.3.1 Bt和线虫的关系 |
| 1.3.2 Bt中杀线虫Cry蛋白简介 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 线虫材料 |
| 2.1.3 培养基及抗生素 |
| 2.1.4 仪器设备及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌质粒提取 |
| 2.2.2 DNA体外重组操作 |
| 2.2.3 DNA片段回收 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.6 大肠杆菌重组克隆子的筛选 |
| 2.2.7 重组蛋白的异源表达纯化 |
| 2.2.8 Cry蛋白的制备和纯化 |
| 2.2.9 秀丽隐杆线虫的液体培养 |
| 2.2.10 秀丽隐杆线虫总蛋白提取 |
| 2.2.11 秀丽隐杆线虫GPI锚定蛋白提取 |
| 2.2.12 蛋白质定量 |
| 2.2.13 蛋白质电泳 |
| 2.2.14 Western杂交 |
| 2.2.15 蛋白质的生物素标记 |
| 2.2.16 亲和层析 |
| 2.2.17 ELISA |
| 2.2.18 蛋白质的罗丹明标记 |
| 2.2.19 碘化丙啶扩散实验 |
| 2.2.20 溶酶体形态观察 |
| 2.2.21 秀丽隐杆线虫的同步化 |
| 2.2.22 秀丽隐杆线虫生测实验 |
| 2.2.23 秀丽隐杆线虫总RNA提取与反转录 |
| 2.2.24 秀丽隐杆线虫总DNA提取 |
| 2.2.25 实时荧光定量PCR |
| 2.2.26 线粒体膜电势的测量 |
| 2.2.27 线粒体形态的观察 |
| 2.2.28 NAD/NADH的测量 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GPI锚定蛋白RBT-1是Cry6A的功能受体 |
| 3.1.1 线虫中GPI锚定蛋白的提取 |
| 3.1.2 通过亲和层析筛选与Cry6A互作的蛋白 |
| 3.1.3 与Cry6A结合的蛋白为含有CUB-like结构域的RBT-1 |
| 3.1.4 RBT-1与Cry6A蛋白互作的验证 |
| 3.1.5 RBT-1 介导了Cry6A的杀线虫活性 |
| 3.1.6 RBT-1 介导Cry6A与线虫肠道相互作用 |
| 3.1.7 RBT-1 介导Cry6A的成孔活性 |
| 3.1.8 RBT-1不参与坏死途径 |
| 3.1.9 RBT-1 不介导Cry5B的杀线虫活性 |
| 3.2 线粒体是Cry5B杀线虫的胞内靶标 |
| 3.2.1 Cry5B引起线虫系统性的线粒体损伤 |
| 3.2.2 线粒体膜电势下降可以增强Cry5B的杀线虫活性 |
| 3.2.3 抑制呼吸链可以降低线虫线粒体膜电势 |
| 3.2.4 抑制呼吸链活性可以增加Cry5B杀线虫活性 |
| 3.2.5 Cry5B可以降低线虫呼吸链复合物I的活性 |
| 3.2.6 ROS可以增加Cry5B杀线虫活性 |
| 3.2.7 Cry5B引起线虫线粒体形态变化 |
| 3.2.8 线粒体分裂介导Cry5B杀线虫活性 |
| 3.2.9 Cry5B引起线虫中线粒体含量下降 |
| 3.2.10 线粒体含量减少可以增强Cry5B杀线虫活性 |
| 3.2.11 Cry21A可以引起系统性线粒体破坏 |
| 4 讨论与展望 |
| 4.1 RBT-1 作为Cry6A受体的作用地位的探讨 |
| 4.2 线虫中Cry6A杀线虫活性与内吞的关系 |
| 4.3 Cry6A作用线虫的磷酸化蛋白质组分析 |
| 4.4 线粒体是杀线虫Cry蛋白的作用靶标 |
| 4.5 线粒体可能参与线虫免疫应答 |
| 4.6 线粒体自噬在Cry5B杀线虫过程中的作用 |
| 4.7 Bt制剂的应用方面 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（2）苏云金芽胞杆菌在不同植物叶片分布差异的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌的的分布及生物学特性 |
| 1.3 新型杀虫基因的挖掘 |
| 1.3.1 基于DNA层面对新基因的挖掘 |
| 1.3.2 基于蛋白层面对新基因的挖掘 |
| 1.3.3 基于基因组测序技术对新基因的挖掘 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌的杀虫蛋白 |
| 1.4.1 Bt蛋白的命名 |
| 1.4.2 Bt杀虫蛋白的分类 |
| 1.4.3 晶体蛋白的结构与功能 |
| 1.5 从植物中分离苏云金芽胞杆菌的研究 |
| 1.5.1 从种子植物中分离Bt |
| 1.5.2 从孢子植物中分离Bt |
| 1.6 苏云金芽胞杆菌在害虫绿色防控中的应用 |
| 1.7 研究内容和目的意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 植物叶片苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及生物活性分析 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 植物叶片的采集与保存 |
| 3.1.2 主要生化试剂和配方 |
| 3.1.3 实验仪器设备 |
| 3.1.4 培养基配制方法 |
| 3.1.5 供试昆虫 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 热处理法分离Bt菌株 |
| 3.2.2 光学显微镜观察晶体的形态特征 |
| 3.2.3 Bt菌株的保存 |
| 3.2.4 菌株基因组的提取 |
| 3.2.5 鉴定引物PCR分析 |
| 3.2.6 PCR扩增条件 |
| 3.2.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.8 菌株胞晶混合物的制备 |
| 3.2.9 聚丙烯酰胺凝胶的配制 |
| 3.2.10 SDS-PAGE分析 |
| 3.2.11 染色和脱色 |
| 3.2.12 菌株胞晶混合物对小菜蛾生物活性的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 植物叶片采集分析 |
| 3.3.2 Bt菌株分离情况 |
| 3.3.3 部分晶体形态观察 |
| 3.3.4 菌株cry基因型鉴定 |
| 3.3.5 Bt菌株的晶体蛋白SDS-PAGE图谱分析 |
| 3.3.6 菌株对小菜蛾生物活性的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 北京植物园和廊坊试验基地所采集的植物样本汇总 |
| 附录2 用于分离Bt菌株的植物叶片样本 |
| 作者简介 |
（3）苏云金芽胞杆菌BMB171合成黑色素机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 黑色素研究进展 |
| 1.1.1 黑色素的分类 |
| 1.1.2 黑色素的结构 |
| 1.1.3 黑色素的生物合成途径 |
| 1.1.4 黑色素的性质 |
| 1.1.5 黑色素的功能 |
| 1.1.6 黑色素在细胞中的分布 |
| 1.2 黑色素形成相关蛋白 |
| 1.2.1 酪氨酸酶 |
| 1.2.2 漆酶 |
| 1.2.3 4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶 |
| 1.2.4 尿黑酸双加氧酶 |
| 1.2.5 聚酮合酶 |
| 1.2.6 羟基苯乙酸羟化酶 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌概述 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌应用存在问题及解决办法 |
| 1.5 苏云金芽胞杆菌合成黑色素研究进展 |
| 1.6 苏云金芽胞杆菌合成黑色素机制研究的目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 常规DNA操作 |
| 2.2.2 苏云金芽胞杆菌黑色素的研究方法 |
| 2.2.3 蛋白的超量表达与纯化 |
| 2.2.4 蛋白的SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.5 蛋白的定量 |
| 2.2.6 酶的活性检测 |
| 2.2.7 序列分析软件及网站 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 尿黑酸黑色素的研究 |
| 3.1.1 苏云金芽胞杆菌生成以尿黑酸为前体物的黑色素 |
| 3.1.2 尿黑酸介导的酪氨酸代谢途径在苏云金芽胞杆菌菌株中的广泛存在 |
| 3.1.3 苏云金芽胞杆菌尿黑酸双加氧酶结构与功能相关研究 |
| 3.1.4 尿黑酸双加氧酶在芽胞杆菌属中的分布 |
| 3.2 其他黑色素相关因子研究 |
| 3.2.1 Laccase-like蛋白功能研究 |
| 3.2.2 其他黑色素相关蛋白 |
| 4 总结与讨论 |
| 4.1 苏云金芽胞杆菌具有通过失活尿黑酸双加氧酶产生以尿黑酸为前体物的黑色素的潜力 |
| 4.2 苏云金芽胞杆菌株中黑色素的形成机制复杂多样 |
| 4.3 苏云金芽胞杆菌产Pyomelanin的生物学意义 |
| 4.4 利用HmgA突变合成黑色素可能是Bt适应特殊环境的一种方式 |
| 4.5 苏云金芽胞杆菌除了作为微生物杀虫剂外还有更广泛的用途 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文及申请专利 |
（4）小菜蛾先天免疫系统对苏云金芽胞杆菌的免疫应答机制探究（论文提纲范文）
| 论文主要缩列词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 小菜蛾概况 |
| 1.1.1小菜蛾及其为害状况 |
| 1.1.2 小菜蛾防治 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.3 昆虫先天免疫系统 |
| 1.4 酚氧化酶原级联激活系统 |
| 1.5 高通量测序技术 |
| 1.5.1 真核有参转录组测序 |
| 1.5.2 基因定量 |
| 1.5.3 差异基因分析 |
| 1.6 本论文的研究目的和意义 |
| 2 材料试剂与仪器 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 试剂、溶液配制 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 实验材料及样本的制备 |
| 3.1.1 苏云金芽孢杆菌的培养与观察 |
| 3.1.2 Cry2Ab蛋白的制备 |
| 3.1.3 转录组测定样本的制备 |
| 3.2 转录组测序结果的分析与差异基因的qPCR验证 |
| 3.2.1 转录组结果分析与差异基因筛选 |
| 3.2.2 小菜蛾免疫相关基因的实时荧光定量PCR分析 |
| 3.3 小菜蛾体内酚氧化酶含量的测定 |
| 3.4 小菜蛾基因PAP3、PPO1、PPO2的克隆与原核表达 |
| 3.4.1 分子克隆相关实验方法 |
| 3.4.2 PAP3、PPO1、PPO2基因的克隆 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 实验材料的制备 |
| 4.1.1 苏云金芽胞杆菌的培养及观察结果 |
| 4.1.2 Cry2Ab蛋白表达及纯化 |
| 4.2 差异表达基因的筛选与分析 |
| 4.2.1 测序结果质量分析 |
| 4.2.2 样品表达水平对比 |
| 4.2.3 差异基因筛选和聚类分析 |
| 4.2.4 差异表达基因的GO功能显着性富集分析 |
| 4.2.5 差异表达基因的KEGG功能显着性富集分析 |
| 4.2.6 显着性差异表达基因的验证 |
| 4.3 小菜蛾体内酚氧化酶含量测定 |
| 4.4 qPCR检测基因PxPAP3、PPO1、PPO2的表达变化 |
| 4.5 小菜蛾PAP3、PPO1、PPO2基因的克隆与原核表达载体 |
| 4.5.1 PxPAP基因克隆与原核表达 |
| 4.5.2 PPO1、PPO2基因克隆及原核表达 |
| 5 讨论 |
| 5.1 小菜蛾酚氧化酶原系统对苏云金芽孢杆菌的应答 |
| 5.2 转录组测序分析小菜蛾先天免疫相关基因 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 7 参考文献 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）芽胞杆菌生物防治作用机理与应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 芽胞杆菌基因组学研究 |
| 2 芽胞杆菌生物防治机理研究 |
| 2.1 芽胞杆菌次生代谢与抑菌作用 |
| 2.2 芽胞杆菌生物膜与竞争作用 |
| 2.3 植物-芽胞杆菌-病原菌互作与诱导植物抗性 |
| 2.3.1 芽胞杆菌-病原菌互作 |
| 2.3.2 芽胞杆菌与植物互作 |
| 2.3.3 芽胞杆菌与其他微生物互作 |
| 2.3.4 植物-芽胞杆菌-病原菌互作 |
| 3 芽胞杆菌功能拓展的分子改良 |
| 4 生防芽胞杆菌应用现状 |
| 5 展望 |
（6）贵州地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白 |
| 1.3 Bt菌晶体蛋白结构与功能作用 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌其它活性因子 |
| 1.4.1 营养期杀虫蛋白 |
| 1.4.2 外毒素 |
| 1.4.3 肠毒素 |
| 1.4.4 几丁质酶 |
| 1.4.5 双效菌素 |
| 1.4.6 Bt其它的毒力因子 |
| 1.5 苏云芽胞杆菌的开发应用 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 土样采集 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 培养基与抗生素 |
| 2.1.4 主要实验试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 供试昆虫 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 苏云金芽胞杆菌的分离与晶体类型观察 |
| 2.2.2 Bt菌SEM观察 |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌基因组的提取 |
| 2.2.4 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的提取 |
| 2.2.5 菌株晶体蛋白浓度测定与SDS-PAGE检测 |
| 2.2.6 HD73-感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 质粒转化 |
| 2.2.8 阳性转化子的筛选与鉴定 |
| 2.2.9 质粒去甲基化 |
| 2.2.10 PCR扩增操作 |
| 2.2.11 酶切和连接体系 |
| 2.2.12 PCR扩增产物的回收和连接 |
| 2.2.13 质粒提取及穿梭表达载体的构建 |
| 2.2.14 苏云金芽胞杆菌基因的鉴定 |
| 2.2.15 PCR-RFLP分析 |
| 2.2.16 菌株室内生物活性分析 |
| 2.2.17 基因组测序以及组装 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 菌株分离结果 |
| 3.1.1 菌株的分离 |
| 3.1.2 伴胞晶体形态的多样性 |
| 3.1.3 基因型鉴定 |
| 3.1.4 Bt菌株蛋白检测分析 |
| 3.1.5 Bt菌株对棉铃虫的生物活性研究 |
| 3.1.6 苏云金芽胞杆菌CS72-2和CS137-2的菌株特征 |
| 3.1.7 菌株CS72-2和CS137-2蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.1.8 Bt菌株CS72-2和CS137-2生物活性测定 |
| 3.2 2株Bt菌株杀虫基因的挖掘 |
| 3.3 菌株CS72-2和CS137-2中基因的克隆、表达研究 |
| 3.3.1 新基因的全长扩增与克隆 |
| 3.3.2 基因序列分析 |
| 3.3.4 cry28-like基因的克隆与蛋白表达 |
| 3.3.5 cry37-like和cyt2-like克隆与蛋白表达 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）dlt操纵子在苏云金芽胞杆菌与昆虫相互作用中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 苏云金芽胞杆菌的研究背景及应用现状 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌的研究历史 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌的生物学特征及分布 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌的应用 |
| 2 苏云金芽胞杆菌的杀虫活性成分及其作用机制 |
| 2.1 杀虫晶体蛋白 |
| 2.2 营养期杀虫蛋白 |
| 2.3 几丁质酶 |
| 2.4 免疫抑制因子A |
| 2.5 其他活性物质 |
| 3 dlt操纵子的简介 |
| 3.1 dlt操纵子的结构 |
| 3.2 dlt操纵子的作用机制 |
| 3.3 alt操纵子的功能 |
| 4 dlt操纵子的研究进展 |
| 5 立题依据和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试菌株及质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 DNA引物合成及测序 |
| 1.4 抗生素 |
| 1.5 主要试剂和试剂盒 |
| 1.5.1 分子生物学试剂及试剂盒 |
| 1.5.2 核酸电泳试剂 |
| 1.5.3 大肠杆菌热转感受态细胞溶液制备 |
| 1.5.4 Bt电转感受态溶液制备 |
| 1.5.5 RNA提取及逆转录试剂 |
| 1.5.6 菌保液试剂 |
| 1.5.7 细胞试剂 |
| 1.6 主要仪器 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 菌株培养条件及保藏方法 |
| 2.2 Bt基因组DNA的提取 |
| 2.3 PCR扩增 |
| 2.4 PCR产物纯化 |
| 2.5 酶切及连接体系 |
| 2.6 DNA胶回收 |
| 2.7 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 2.8 DNA热转化 |
| 2.9 质粒DNA的提取 |
| 2.10 DNA电转化 |
| 2.11 菌落PCR |
| 2.12 42℃消除温敏型质粒 |
| 2.13 突变株ΔdltA的构建 |
| 2.13.1 构建重组质粒pRec-mob-Ts-up-down |
| 2.13.2 pRec-mob-Ts-up-down电转化 Bt BMB171 |
| 2.14 互补株和空载体菌株的构建 |
| 2.15 RNA的提取及其逆转录 |
| 2.15.1 RNA提取 |
| 2.15.2 消除残留的基因组DNA |
| 2.15.3 逆转录 |
| 2.15.4 实时荧光定量PCR分析 |
| 2.16 细胞培养 |
| 2.16.1 细胞复苏 |
| 2.16.2 细胞增殖与传代 |
| 2.16.3 细胞冻存 |
| 2.17 阳离子染料阿尔辛蓝结合测定 |
| 2.18 生长曲线的测定 |
| 2.19 菌株的显微镜观察 |
| 2.20 阳离子抗菌肽(AMPs)的敏感性分析 |
| 2.21 温度、pH耐受性分析 |
| 2.22 细胞结合实验 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 构建ΔdltA突变菌株 |
| 3.1.1 构建pRec-mob-Ts-up-down质粒 |
| 3.1.2 鉴定ΔdltA突变菌株 |
| 3.2 构建互补株及空载体菌株 |
| 3.3 dlt操纵子缺失显着增强细胞表面负电荷 |
| 3.4 dlt操纵子缺失导致菌株生长量显着减少 |
| 3.5 dlt操纵子缺失延迟芽胞形成但不改变菌体形态 |
| 3.6 dlt操纵子缺失导致菌株耐酸性增强、耐碱性减弱 |
| 3.7 dlt操纵子缺失显着增强对AMPs的敏感性 |
| 3.8 dlt操纵子缺失显着增强菌体对昆虫中肠细胞的黏附 |
| 第四章 讨论 |
| 1. dlt操纵子对细胞表面电荷的影响 |
| 2. dlt操纵子对生长量的影响 |
| 3. dlt操纵子对环境耐受性的影响 |
| 4. dlt操纵子对其与靶细胞相互作用的影响 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词(中英文对照) |
| 致谢 |
（8）蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物对丁香假单胞菌及南方根结线虫抗性机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 微生物防治植物病害的机理研究进展 |
| 第一节 |
| 1 国内外芽胞杆菌的研究及其应用现状 |
| 1.1 国内芽胞杆菌的生防研究概况 |
| 1.2 国外芽胞杆菌的生防研究进展 |
| 2 芽胞杆菌生防机理研究 |
| 2.1 抗菌作用 |
| 2.2 溶菌作用 |
| 2.3 竞争作用 |
| 2.4 诱导系统抗病性 |
| 3 芽胞杆菌在农业生产应用中面临的问题及解决途径 |
| 3.1 芽胞杆菌生物农药面临的问题 |
| 3.2 针对芽胞杆菌生物农药问题的解决方法 |
| 3.3 芽胞杆菌生物农药未来发展展望 |
| 第二节 蜡质芽胞杆菌生防机理研究进展 |
| 1 国内外芽胞杆菌的研究及应用现状 |
| 2 蜡质芽胞杆菌生防机理研究 |
| 2.1 竞争作用 |
| 2.2 拮抗作用 |
| 2.3 诱导系统抗病性 |
| 3 问题与展望 |
| 第二章 植物防卫系统与诱导抗性 |
| 第一节 植物防卫系统与诱导抗性概述 |
| 1 根围免疫信号 |
| 2 植物系统获得性抗性(SAR) |
| 3 诱导系统抗病性(ISR) |
| 4 关键调控因子 |
| 4.1 NPR1调节因子 |
| 4.2 WRKY转录因子 |
| 4.3 植物诱导抗病过程中的Priming |
| 第二节 微生物胞外多糖的功能研究概述 |
| 1 多糖的种类 |
| 1.1 按照多糖的来源 |
| 1.2 按照微生物分泌的多糖部位 |
| 2 微生物胞外多糖的生物活性 |
| 2.1 保护作用 |
| 2.2 识别作用 |
| 2.3 储存能量 |
| 2.4 粘合作用 |
| 2.5 提升机体免疫力 |
| 2.6 抑制肿瘤细胞生长 |
| 3 微生物胞外多糖的应用 |
| 3.1 微生物胞外多糖在农业领域内的应用 |
| 4 总结 |
| 第三节 Small RNAs在植物内源免疫中的调控作用 |
| 1. 参与small RNAs合成的基本成分及作用 |
| 1.1 Dicer酶 |
| 1.2 AGO蛋白 |
| 1.3 RNA依赖性RNA聚合酶 |
| 2 Small RNAs的种类及生物合成 |
| 2.1 microRNAs的生物合成 |
| 2.2 siRNAs的生物合成 |
| 3. Small RNAs的作用机制 |
| 4. Small RNAs在植物内源免疫中的抗病作用 |
| 5. 总结 |
| 第三章 蔬菜根结线虫病害综合防治研究进展 |
| 1 根结线虫的分类学地位 |
| 2 根结线虫的发生规律 |
| 3 根结线虫的寄主范围和传播途径 |
| 4 根结线虫的为害特点及症状 |
| 5 根结线虫病害的防治策略 |
| 5.1 农业防治措施 |
| 5.2 物理防治措施 |
| 5.3 化学防治措施 |
| 5.4 生物防治措施 |
| 6 目前根结线虫防治中存在的问题及发展前景 |
| 第四章 根结线虫病害的生防机理研究进展 |
| 1 根结线虫病害的生防机理 |
| 1.1 寄生作用 |
| 1.2 捕食作用 |
| 1.3 毒杀作用 |
| 1.4 诱导植物产生系统抗病性 |
| 2 问题和展望 |
| 第五章 植物线虫效应因子在调控病害防治过程中的作用研究 |
| 1 线虫效应因子注入寄主植物细胞的调控 |
| 2 线虫效应因子作为植物细胞生物学的探针 |
| 2.1 细胞周期与骨架 |
| 2.2 细胞壁结构 |
| 2.3 新陈代谢 |
| 3 效应因子的功能性研究 |
| 3.1 基因沉默 |
| 3.2 寄主靶标识别 |
| 4 线虫效应因子分类 |
| 5. 线虫效应因子的识别研究 |
| 6 线虫效应因子在全球范围内的研究进展 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导系统抗性过程中的作用机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 转录因子WRKY11与WRKY70基因克隆及过表达载体构建过程 |
| 1.5 转录因子WRKY11与WRKY70基因过表达拟南芥以及转录因子WRKY11,WRKY70双突变体植株的构建 |
| 1.6 植物内源水杨酸、茉莉酸含量检测 |
| 1.7 引物信息 |
| 1.8 转录因子WRKY11与WRKY70亚细胞定位 |
| 1.9 Bc AR156对拟南芥促生作用表型测定 |
| 1.10 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性表型测定 |
| 1.11 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性的分子水平检测 |
| 1.12 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性的细胞水平检测 |
| 1.13 Western blot |
| 1.14 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录因子WRKY11和WRKY70参与调控Bc AR156诱导系统抗性 |
| 2.2 转录因子WRKY11和WRKY70都定位于细胞核 |
| 2.3 转录因子WRKY11和WRKY70参与调控Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性 |
| 2.4 转录因子WRKY11和WRKY70参与调控Bc AR156诱导拟南芥内细胞防卫反应 |
| 2.5 转录因子WRKY11和WRKY70是Bc AR156诱导拟南芥内防卫相关基因的上调表达所必需的 |
| 2.6 转录因子WRKY11和WRKY70靶标基因在Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性过程中的表达情况 |
| 2.7 水杨酸、茉莉酸/乙烯信号通路,以及NPR1参与转录因子WRKY11和WRKY70调控Bc AR156诱导的系统抗性 |
| 2.8 Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性并非通过影响植物内源激素的合成 |
| 3 讨论 |
| 第二章 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖作为一类MAMPS激活植物系统免疫 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 Bc AR156胞外多糖的提取与纯化 |
| 1.5 过敏性反应（HR)分析 |
| 1.6 Bc AR156各组分对Pst DC3000的平板拮抗试验 |
| 1.7 蜡质芽胞杆菌胞外多糖诱导抗性表型验证试验 |
| 1.8 Pst DC3000在拟南芥上的定殖量测定 |
| 1.9 Bc AR156胞外多糖诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性的细胞水平的检测 |
| 1.10 拟南芥总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 1.11 拟南芥叶片总蛋白的提取与Western blotting分析 |
| 1.12 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bc AR156胞外多糖能够诱导植物产生过敏性反应 |
| 2.2 Bc AR156胞外多糖诱导拟南芥产生对Pst DC3000的系统抗性 |
| 2.3 Bc AR156胞外多糖诱导拟南芥防卫相关基因的表达 |
| 2.4 Bc AR156胞外多糖激活植物体免疫诱导活性氧的积累、胼胝质的沉积以及防卫相关酶活性增加 |
| 2.5 AR156胞外多糖在拟南芥中诱导的系统抗性通过SA信号途径,并依赖NPR1 |
| 2.6 Bc AR156胞外多糖在拟南芥中诱使的系统抗性通过MAPK信号途径。 |
| 2.7 Bc AR156胞外多糖的化学分析及结构鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 SMALL RNAS在生防菌诱导植物抗病中的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 转基因植物的构建 |
| 1.5 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性表型测定 |
| 1.6 miRNA靶基因的预测 |
| 1.7 拟南芥总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 1.8 Northern Blot |
| 1.9 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miRNA参与调控Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000系统抗性 |
| 2.2 miR472,miR825/825*参与调控Bc AR156激活的ISR |
| 2.3 miR472、miR825/825*过表达或者缺失能够影响植物基础免疫 |
| 2.4 miR472、miR825/825* target植物内源R基因,调控植物基础免疫 |
| 3 讨论 |
| 第四章 蜡质芽胞杆菌AR156调控植物根系发育防治根结线虫病害的机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 根结线虫二龄幼虫(J2)悬浮液的制备 |
| 1.5 蜡质芽胞杆菌引起番茄根系变化观察 |
| 1.6 线虫对番茄根系侵染率检测 |
| 1.7 温室防效实验 |
| 1.8 转录组测序与分析 |
| 1.9 番茄根组织总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bc AR156高效防治番茄根结线虫病 |
| 2.2 Bc AR156诱导番茄根系结构变化,加速番茄根系得成熟化 |
| 2.3 Bc AR156诱导番茄根系结构变化,降低根结线虫侵染 |
| 2.4 Bc AR156调控番茄根系相关基因的表达 |
| 2.5 转录组学预测相关调控基因Q-RT-PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 第五章 蜡质芽胞杆菌AR156调控根结线虫效应因子表达防治病害的机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 根结线虫二龄幼虫(J2)悬浮液的制备 |
| 1.5 转录组测序与分析 |
| 1.6 效应因子分析和预测 |
| 1.7 番茄根组织总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序结果分析 |
| 2.2 Q-RT-PCR结果验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结及展望 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与专利 |
| 致谢 |
（9）高海拔地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.1.1 Bt研究历史 |
| 1.1.2 Bt生物学特性 |
| 1.2 BT的重要活性因子 |
| 1.2.1 ICPs形态及生物特性 |
| 1.2.2 营养期杀虫蛋白 |
| 1.2.3 外毒素 |
| 1.2.4 几丁质酶 |
| 1.3 杀虫晶体蛋白研究现状 |
| 1.3.1 ICPs结构域 |
| 1.3.2 ICPs命名 |
| 1.3.3 ICPs编码基因的克隆鉴定 |
| 1.4 ICPs杀虫机制研究 |
| 1.5 ICPs杀虫活性研究 |
| 1.6 ICPs的开发和应用 |
| 1.6.1 Bt转基因工程菌 |
| 1.6.2 Bt转基因植物 |
| 1.7 立题依据和研究目的以及意义 |
| 2. 苏云金芽胞杆菌的分离、生物活性验证与基因鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 土样采集 |
| 2.1.2 培养基与抗生素 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 供试昆虫 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 苏云金芽胞杆菌的分离与晶体类型观察 |
| 2.2.2 苏云金芽胞杆菌基因组的提取 |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的提取 |
| 2.2.4 菌株晶体蛋白浓度测定与SDS-PAGE检测 |
| 2.2.5 苏云金芽胞杆菌基因的鉴定 |
| 2.2.6 PCR-RFLP分析 |
| 2.2.7 菌株室内生物活性分析 |
| 2.2.8 杀虫基因鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 菌株分离结果 |
| 2.3.2 伴胞晶体形态的多样性 |
| 2.3.3 苏云金芽胞杆菌cry基因的鉴定 |
| 2.3.4 Bt分离株SDS-PAGE蛋白分析 |
| 2.3.5 Bt菌株的生物活性研究 |
| 2.3.6 杀虫基因鉴定 |
| 3. CRY新基因的克隆表达与功能验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 研究中所用的菌株和质粒 |
| 3.1.2 培养基与抗生素 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.1.4 主要实验试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 苏云金芽胞杆菌基因组提取与蛋白提取 |
| 3.2.3 基因组测序以及组装 |
| 3.2.4 大肠杆菌质粒的抽提 |
| 3.2.5 扫描电子显微镜对供试菌株的晶体形态观察 |
| 3.2.6 Bt感受态细胞的制备 |
| 3.2.7 连接反应 |
| 3.2.8 转化 |
| 3.2.9 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 3.2.10 新基因的全长扩增与克隆 |
| 3.2.11 新基因的序列分析 |
| 3.2.12 新基因的表达载体的构建 |
| 3.2.13 新基因蛋白表达 |
| 3.2.14 新基因的室内生物活性分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 菌株的选择 |
| 3.3.2 3株Bt菌株的杀虫活性分析 |
| 3.3.3 3株Bt菌株杀虫基因的挖掘 |
| 3.3.4 3株Bt菌株的杀虫基因全长的扩增 |
| 3.3.5 基因cry32Y-like克隆、表达研究 |
| 3.3.6 基因cry32X-like、cry9H-like与cry72A-like的克隆、表达研究 |
| 3.3.7 新基因表达蛋白生物活性测定 |
| 3.4 已知基因的蛋白表达与杀虫活性分析 |
| 3.4.1 基因cry71Aa1与cry72Aa1表达研究与杀虫活性验证 |
| 3.4.2 已知基因对线虫的杀虫活性验证 |
| 4. 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的科研论文情况 |
| 参与的国家发明专利 |
| 硕士在读期间NCBI注册的新型基因 |
（10）云南地区苏云金芽胞杆菌的分离鉴定和对几种鳞翅目害虫生长发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌的历史 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 |
| 1.3.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因 |
| 1.3.2 杀虫晶体蛋白基因的分类 |
| 1.3.3 杀虫晶体蛋白(ICP)的结构 |
| 1.3.4 杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌在农业生产中的应用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 土样 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 酶与试剂 |
| 2.1.4 供试昆虫 |
| 2.1.5 仪器与设备 |
| 2.1.6 PCR-PFLP |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 Bt菌株的分离与保存 |
| 2.2.2 扫描电镜的观察 |
| 2.2.3 Bt总DNA及质粒DNA的提取 |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳及胶回收 |
| 2.2.6 Bt蛋白的提取 |
| 2.2.7 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.2.8 生物测定 |
| 2.2.9 统计方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株的分离 |
| 3.2 伴胞晶体形态多样性 |
| 3.3 基因型的鉴定 |
| 3.4 Bt菌株的蛋白晶体鉴定 |
| 3.5 生物测定 |
| 3.6 五株Bt菌的生物学特性 |
| 3.6.1 PCR分析结果 |
| 3.6.2 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 3.7 玉米螟取食含不同Bt菌的半人工饲料对其生长发育的影响 |
| 3.7.1 Bt菌对玉米螟幼虫平均虫体长度变化的影响 |
| 3.7.2 Bt菌对玉米螟幼虫平均存活率变化的影响 |
| 3.7.3 玉米螟取食含菌饲料后在不同时间的化蛹情况 |
| 3.7.4 Bt菌对玉米螟幼虫的化蛹率、畸形率、羽化率的影响 |
| 3.7.5 Bt菌对玉米螟幼虫的虫态历期、蛹期、羽化期的影响 |
| 3.8 甜菜夜蛾取食含不同Bt菌的半人工饲料对其生长发育的影响 |
| 3.8.1 Bt菌对甜菜夜蛾幼虫平均虫体长度变化的影响 |
| 3.8.2 Bt菌对甜菜夜蛾幼虫平均存活率变化的影响 |
| 3.8.3 甜菜夜蛾取食含菌饲料后在不同时间的化蛹情况 |
| 3.8.4 Bt菌对甜菜夜蛾幼虫的化蛹率、畸形率、羽化率的影响 |
| 3.8.5 Bt菌对甜菜夜蛾幼虫的虫态历期、蛹期、羽化期的影响 |
| 3.9 棉铃虫取食含不同Bt菌的半人工饲料对其生长发育的影响 |
| 3.9.1 Bt菌对棉铃虫幼虫平均虫体长度变化的影响 |
| 3.9.2 Bt菌对棉铃虫幼虫平均存活率变化的影响 |
| 3.9.3 棉铃虫取食含菌饲料后在不同时间的化蛹情况 |
| 3.9.4 Bt菌对甜菜夜蛾幼虫的化蛹率、畸形率、羽化率的影响 |
| 3.9.5 Bt菌对棉铃虫幼虫的虫态历期、蛹期、羽化期的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 硕士在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、苏云金芽胞杆菌研究进展（论文参考文献）
- [1]苏云金芽胞杆菌Cry6A和Cry5B蛋白杀线虫机制研究[D]. 石建伟. 华中农业大学, 2020(01)
- [2]苏云金芽胞杆菌在不同植物叶片分布差异的研究[D]. 宋海洋. 安徽农业大学, 2019(05)
- [3]苏云金芽胞杆菌BMB171合成黑色素机制研究[D]. 杨文君. 华中农业大学, 2019(01)
- [4]小菜蛾先天免疫系统对苏云金芽胞杆菌的免疫应答机制探究[D]. 牛丽洋. 厦门大学, 2019(11)
- [5]芽胞杆菌生物防治作用机理与应用研究进展[J]. 马佳,李颖,胡栋,彭杰丽,贾楠,张翠绵,王旭,王占武. 中国生物防治学报, 2018(04)
- [6]贵州地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证[D]. 付成林. 四川农业大学, 2018(02)
- [7]dlt操纵子在苏云金芽胞杆菌与昆虫相互作用中的功能研究[D]. 王海文. 湖南师范大学, 2017(01)
- [8]蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物对丁香假单胞菌及南方根结线虫抗性机理研究[D]. 蒋春号. 南京农业大学, 2016(05)
- [9]高海拔地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证[D]. 黄刚辉. 四川农业大学, 2016(05)
- [10]云南地区苏云金芽胞杆菌的分离鉴定和对几种鳞翅目害虫生长发育的影响[D]. 刘瑶. 四川农业大学, 2016(02)