一、鸡新城疫病毒分离株与La Sota株灭活疫苗效力比较试验（论文文献综述）
姚瑶[1]（2021）在《新城疫病毒基因Ⅰ/Ⅶ型F和HN基因嵌合弱毒疫苗候选株LX-OAI4S的构建和免疫效力评价》文中提出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）强毒株引起的禽类高度接触性传染病,被公认为是除高致病性禽流感外对全球养禽业危害最为严重的禽类疾病。近年来NDV分子流行病学数据显示,我国鸡群和水禽中NDV主要的流行基因型为基因Ⅶ型。2014年针对ND基因Ⅶ型的灭活疫苗A-Ⅶ问世,使得我国基因Ⅶ型NDV的流行得到了有力控制。但由于灭活疫苗主要依赖于注射免疫,免疫操作过程中往往带来较强烈的动物应激,同时大规模免疫下花费的人力成本较高,因此迫切需要适用于喷雾、饮水等大规模免疫途径的ND弱毒活疫苗。本研究以Ⅰ型NDV为骨架,构建一株表达基因Ⅶ型F和HN蛋白胞外区的嵌合重组病毒,并通过不同的免疫方式对该重组毒进行免疫效力评价。1.重组嵌合疫苗株LX-OAI4S的构建及滴鼻点眼免疫效力评价为获得一株安全性好、抗原性与流行株相匹配的ND疫苗株,本研究以基因Ⅰ型NDV弱毒株LX为骨架,将实验室前期获得的A-Ⅶ疫苗株的F和NDV强毒JS14/12/Ch株HN基因胞外区替换至骨架毒株相应区域,利用反向遗传技术成功拯救获得重组嵌合病毒LX-OAI4S。重组嵌合病毒LX-OAI4S毒力弱（ICPI=0.00,MDT>120h）,在鸡胚中能高效复制（EID50=10-9/0.1 mL）。将该毒株在鸡胚中连续传9代,毒力和繁殖能力依然保持稳定。为比较重组嵌合病毒株LX-OAI4S的免疫原性,LX-OAI4S和另一个前期获得的疫苗候选株LX/AI4-E34K分别以106 EID50、105 EID50、104 EID50剂量滴鼻点眼免疫SPF鸡,均能提供100%保护,证明最小免疫剂量为104 EID50。LX-OAI4S疫苗株105 EID50剂量组和106 EID50剂量组在免疫后第一周平均HI抗体水平分别达到6.30 log2和6.53 log2,明显高于LX/AI4-E347K株的相同剂量组,这些结果表明LX-OAI4S株免疫原性优于LX/AI4-E347K株。此外,用疫苗候选株LX-OAI4S、商品化弱毒疫苗株La Sota和VG/GA分别免疫3周龄SPF鸡,免疫后一周,LX-OAI4S免疫组血清中HI抗体平均为4.71 log2,比La Sota免疫组（3.43 log2）高1个滴度,比VG/GA免疫组（2.83 log2）高2个滴度;而且免疫后第二周和第三周,LX-OAI4S免疫组血清中HI抗体平均水平均高于其他免疫组。免疫三周后用基因Ⅶ型强毒株JS02/06进行攻毒,攻毒后所有免疫组都没有出现临床症状,攻毒保护率为100%。LX-OAI4S免疫组喉头和泄殖腔未发现排毒,La Sota免疫组和VG/GA免疫组在攻毒后第3天喉头（分别为2/7和3/7）和泄殖腔（分别为2/7和1/7）均有排毒。综上,传统滴鼻点眼免疫方式下LX-OAI4S株的免疫原性优于LX/AI4-E347K株和现有ND活疫苗,是值得期待的疫苗候选株。2.重组嵌合疫苗株LX-OAI4S喷雾免疫效力评价选择LX-OAI4S、La Sota和VG/GA不同免疫剂量喷雾免疫1日龄SPF鸡和商品鸡,连续观察14天,每天称重。所有免疫组鸡体重都呈增长趋势,但SPF鸡免疫后出现了一定的应激,SPF鸡免疫组的体重比对照组增长慢;商品鸡免疫后体重增长正常。不同剂量的La Sota株免疫SPF鸡和商品鸡后都出现了不同程度的呼吸道症状。在2×106 EID50剂量SPF鸡免疫组,LX-OAI4S免疫组诱导的抗体高于La Sota和VG/GA免疫组。免疫两周后攻毒,La Sota组有一只鸡出现神经症状,La Sota组感染后第5和7天泄殖腔可以测到排毒,阳性率为10%;LX-OAI4S组和VG/GA组在观察期内未出现任何的临床症状,免疫保护率为100%,并且喉头和泄殖腔均未测到排毒。在10×106EID50剂量免疫组,La Sota免疫SPF鸡和商品鸡组HI抗体水平均高于其他免疫组,但是La Sota免疫商品鸡组有1只鸡死亡;免疫后14天进行剖检,La Sota组鸡喉头出血比例（SPF鸡8/10,商品鸡8/9）最多,其次是LX-OAI4S组（SPF鸡6/10,商品鸡5/10）,VG/GA对鸡呼吸道的刺激最小（SPF鸡4/10,商品鸡5/10）,但是该组有一只鸡腺胃出血。在LX-OAI4S抗体监测组,前三周抗体滴度增长迅速,第5周达到高峰之后缓慢平稳地下降,监测到第12周的抗体滴度依然能提供保护。证明重组嵌合病毒LX-OAI4S有潜力成为可用于喷雾免疫的候选疫苗株。综上所述,本研究构建了一株重组嵌合弱毒ND疫苗LX-OAI4S,最小免疫剂量可达104 EID50,滴鼻点眼免疫三周龄SPF鸡,能提供100%的临床保护,并能有效减低NDV强毒株的分离率;喷雾免疫1日龄雏鸡,对雏鸡的生长发育影响小,安全性优于La Sota株,免疫效力优于VG/GA株。LX-OAI4S株有望成为安全有效、可用于喷雾免疫的疫苗候选株。
蔡俊呈,陈礼斌,张殿宸,林秋燕,向斌,廖明,徐成刚,任涛[2]（2021）在《新城疫疫苗研究进展》文中认为新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告的动物疫病,我国农业农村部将其列为一类动物传染病,是世界上流行范围最广、对全球养禽业造成最严重经济损失的家禽传染病之一。目前,疫苗免疫仍是控制此病重要的手段,被广泛应用于禽业生产中。随着生物科学和技术的发展,新城疫疫苗的研制与创新也在不断进步。本文将从新城疫疫苗研究现状和主要新城疫疫苗及其优缺点作简要阐述,为新城疫疫苗的研究和合理应用提供参考。
薛景景,侯瑞卿,王婉冰,张盼涛,袁月,郭丽霞,张哲,田辉,刘武杰,田克恭[3]（2021）在《基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究》文中提出旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒（NDV）流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。结果显示,4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围,且PLK-N-06株毒力最强;F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。遗传进化分析表明,分离株均为Ⅶd亚型。交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显着的抗原性差异。用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI抗体效价几何平均值为1∶338,显着高于La Sota疫苗（1∶69）,且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性,为新城疫基因Ⅶ型新型疫苗的研发奠定了基础。
董婷婷,马宁宁,姜磊,张凌云,侯野,郑杰,张乾顺,肖龙,徐宏军[4]（2020）在《鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗悬浮培养（La Sota株+WL-s株）的免疫效力研究》文中研究表明为研制鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（La Sota株+WL-s株,悬浮培养）（以下称"悬浮苗"）,用新城疫病毒La Sota株与H9亚型禽流感病毒WL-s株分别接种易感BHK-21-sc和MDCK-sc悬浮细胞,收获抗原液,制成3批油佐剂"悬浮苗"。按照《中国兽药典》及"悬浮苗"质量标准对疫苗进行性状、装量、无菌检验,并与已上市的鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（La Sota株+WD株）（以下称"鸡胚苗"）进行安全与效力对比。结果显示:3批"悬浮苗"与"鸡胚苗"安全检验,鸡均健活（10/10）,无因注射疫苗引起的局部或全身性反应;3批"悬浮苗"与"鸡胚苗"新城疫部分效力检验鸡血清HI效价的几何平均值分别为5.5～5.7 log2、5.0 log2,禽流感部分效力检验鸡血清HI效价的几何平均值分别为8.9～9.1 log2、7.6 log2;用新城疫北京株攻毒后均90%（9/10）以上保护,对照鸡100%（5/5）死亡;用H9亚型禽流感病毒WL-s株攻毒后均90%（9/10）以上病毒分离阴性,对照鸡100%（5/5）病毒分离阳性。研究结果表明制备的"悬浮苗"安全有效、免疫效力高,与"鸡胚苗"的安全、效力相当。
许曾焜[5]（2020）在《表达新城疫病毒F蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫原性初步评价》文中研究指明重组活载体疫苗是一种以病毒或细菌为载体,将外源保护性抗原基因通过基因工程技术插入载体中并使之表达的疫苗。重组活载体疫苗具有诱导机体产生广泛、长期的免疫反应等优点,并且此类疫苗可同时表达多种抗原,具有成为多价或多联疫苗的潜力,是当下和未来疫苗研制的主要方向之一。马立克氏病病毒（MDV）属疱疹病毒科,其较大的基因组和多个可供外源基因插入的复制非必须区域使之成为构建重组活载体疫苗的良好载体,其中血清3型MDV为火鸡疱疹病毒（HVT）,做为疫苗来预防马立克氏病已有50余年,同时HVT也常被用做载体来表达外源基因。HVT作为载体有许多优势:可接种1日龄雏鸡,不受母源抗体抗扰;非人畜共患,使用安全;一次接种后可持续刺激抗体的产生,无需多次加强免疫;相对于其他全病毒疫苗,只表达保护性抗原成分,不存在毒力返强的风险,并且便于进行免疫监控。新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）强毒株引起的一种禽类烈性传染病,该病致死率极高。对禽类养殖业造成了不可估量的损失。近年来,非典型新城疫的发病率不断增加,呈不同程度的地方性流行,并且在免疫鸡群中也有发生。造成这种现象的原因主要为高水平母源抗体导致的传统疫苗效力降低和ND流行株与疫苗株基因型不匹配等。因此,研制新型有效的疫苗对于ND的防控具有重要意义。本研究旨在建立能够高效拯救病毒的HVT粘粒拯救系统,再将NDV流行株F基因的表达框架插入其中,构建重组病毒并评价其免疫效力,为有效防控新城疫和马立克氏病提供技术支持,具有重要的应用价值。本研究将HVT FC126株基因组分段插入Fosmid粘粒载体pCC1Fos中,构建了FC126株基因组粘粒文库;在此基础上,选取粘粒组合,共转染鸡胚成纤维细胞,建立了HVT FC126疫苗株多片段粘粒拯救系统。通过该拯救系统,将NDV基因VII型流行株LHLJ/01/06株F基因表达框架插入HVT基因组HVT065和HVT066基因之间,构建了重组病毒rHVT-NDV-F。PCR和测序鉴定表明,F基因表达框架成功插入FC126株基因组。间接免疫荧光试验表明,重组病毒rHVT-NDV-F能够表达F蛋白。rHVT-NDV-F重组病毒与其亲本病毒HVT FC126株在体外细胞上的复制能力无显着差异。经过连续传代后,重组病毒rHVT-NDV-F基因组中的F基因表达框架可稳定存在并表达F蛋白。对rHVT-NDV-F重组病毒进行攻毒免疫保护试验,重组病毒rHVT-NDV-F对NDV基因IX型强毒F48E9株的保护率为80%,对NDV基因VII型流行株LHLJ/01/06的保护率为70%。综上,本研究构建了HVT FC126株病毒拯救系统,及能够表达NDV基因VII型F蛋白的重组病毒rHVT-NDV-F;rHVT-NDV-F的体外复制能力与亲本株无显着影响且具有良好的遗传稳定性;该重组病毒能够对当前流行的基因VII型NDV攻毒提供较好的保护,具有作为ND重组HVT活载体疫苗的潜力。
孟令宅[6]（2020）在《基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救》文中认为新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类的一种高度接触性、急性、烈性传染病,世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的传染病,我国将其列为一类动物疫病。NDV只有单一血清型,但存在多种基因型,目前我国主要流行的是Class Ⅱ类型中基因Ⅶ毒株,常规疫苗株B1、Clone30、La Sota及V4疫苗株属于基因Ⅰ型和Ⅱ型,不能有效防控基因Ⅶ型毒株。因此,应迫切研发与当前流行株基因型一致的新型疫苗。基于此,本研究对一株NDVHB株进行了全基因组测序,以此为基础建立了HB株的反向遗传操作平台,并对其F蛋白进行改造,旨在为研发基因Ⅶ型NDV弱毒疫苗提供科学依据。从河北省某发病鸡场的临床样本中检测到一株新城疫病毒,命名为HB,采用RT-PCR方法对HB株的全基因组序列进行分段扩增,并对其基因序列进行结构特性分析及同源进化分析。结果表明HB株基因组全长为15192 bp,基因组3’端存在长为55 nt的引导序列,5’端存在长为114 nt的尾随序列,主要编码的6种结构蛋白,包括基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）、核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、以及RNA依赖性RNA聚合酶蛋白（L）,基因组排列顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’。全基因组遗传进化分析表明,HB株属于Class Ⅱ中的基因Ⅶ型毒株,与鸭源新城疫毒株BP01、Fujian/FP/02、MMd/CH/LGD/1/2005核苷酸的同源性最高（99.1%～99.2%）,进化树上处于同一分支;与中国广泛使用的V4,Mukteswar和La Sota等疫苗株核苷酸的同源性较低（82.9%～85.6%）,进化树上处于不同分支。基于F基因的系统进化树显示,HB株属于基因Ⅶd亚型,是目前我国流行毒株中的优势亚型毒株。通过与其它毒株的序列进行比对,发现在F蛋白的信号肽,七肽重复区和跨膜结构域中出现了 4、16和2个氨基酸突变,在HN蛋白的功能结构域和中和表位分别出现1和5个氨基酸突变,这些关键位点的突变与病毒的吸附性及免疫逃避有关。应用反向遗传操作技术将HB株全长cDNA分为外部基因质粒（M、F及HN）和内部基因质粒（NP、P及L）两部分构建,通过同义突变将L蛋白的3100位点处的碱基A突变为T作为遗传标记,用以与野毒进行区分;利用融合PCR技术将F蛋白的112～117裂解位点的氨基酸序列突变为弱毒株La Sota裂解位点序列,同时构建了三个辅助质粒PCI-NP,PCI-P,PCI-L,将内部基因质粒、外部基因质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞进行病毒拯救,并通过细胞病变、遗传标记检测、基因测序及间接免疫荧光等试验技术对拯救病毒进行鉴定,结果表明,rHB株能在BHK-21细胞上引起典型的细胞病变（CPE）,引入的遗传标记在传代过程中可以稳定遗传,F蛋白裂解位点处氨基酸序列突变成功,病毒拯救成功。对拯救病毒的生长特性进行分析,表明rHB株与HB株在BHK-21细胞上具有相似的生长特性。NDV HB株感染性克隆的成功构建可为进一步研究NDV的致病机制和研发新型基因工程疫苗提供技术平台。
刘晓民,张庆霞,任国鑫,李恒永,周振成,李县斌,郭洪武,李雪娇[7]（2020）在《新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒M41株低免疫鸡胚同胚培养研究》文中研究表明为研究新城疫病毒（NDV）La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）M41株在低免疫鸡胚中进行同胚接种培养的可行性,通过将不同稀释倍数的La Sota株和M41株接种同一低免疫鸡胚,分别测定收获尿囊液La Sota株和M41株含量,确定最佳的稀释倍数以及适宜的培养温度和培养时间。结果显示:La Sota株和M41株以10 000∶5 000的比例稀释,培养96 h病毒含量和收获量最佳,La Sota株含量可达到109.17EID50/0.1 m L,HA效价为1∶1 024,M41株含量可达到106.50EID50/0.1 m L。接种后孵育温度为36.5℃时,每胚收获量比37℃培养增加了1.0～1.2 m L。按照此工艺生产病毒制备疫苗免疫SPF鸡,NDV和IBV抗体均符合国家标准要求。试验探索并优化了La Sota株和M41株在低免疫鸡胚中同胚接种的培养条件,为大规模抗原生产提供数据支持。
董炳梅[8]（2019）在《鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用》文中认为鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）可在多种原代或传代细胞系上复制增殖,但不同毒株或亚型对宿主细胞均存在偏嗜性。为了筛选适于鸡新城疫（Newcastle disease,ND）疫苗生产的传代细胞系,本研究将我国ND疫苗株NDVⅠ系与Lasota株分别接种BHK-21、Vero、Hela、鸡肝癌细胞（LMH细胞）与DF-1细胞,通过对细胞病变的观察,结合对细胞培养物细胞半数感染量(Median cell culture infective dose,TCID50)和HA效价的测定,对比确定适于NDVⅠ系与Lasota株生长的传代细胞系。结果显示,NDVⅠ系与Lasota株在Vero、BHK-21、DF-1、Hela与LMH细胞上均可增殖,并引起典型的细胞病变,但不同毒株适应细胞的能力不同。较适于NDVⅠ系增殖的细胞系依次为Hela、BHK-21与DF-1细胞;较适于NDV Lasota株增殖的细胞系依次为Hela、LMH与BHK-21细胞。本研究证明了NDVⅠ系与Lasota株均可在LMH细胞上增殖,并产生典型的细胞病变,且LMH细胞更适于NDVⅠ系的增殖培养。NDV侵染细胞的第一步是病毒与细胞膜表面的唾液酸受体结合,NDV的唾液酸受体主要包括Neu5Ac-α-2,3Gal-β-1,4Glc（SAα2,3Gal）和Neu5Ac-2-S-α-2,6Gal10Me（SAα2,6Gal）,两种受体在宿主组织器官中的分布及表达丰度的不同对病毒的宿主范围和毒力等方面具有重要影响。为了在分子水平解释NDVⅠ系与Lasota株对不同细胞系的偏嗜性,本研究首先应用激光共聚焦显微镜对2种唾液酸受体在BHK-21等5种细胞上的分布进行了观察,结果显示,BHK-21、LMH、DF-1、Hela与Vero细胞内均存在TSA-R SAα2,6Gal与SAα2,3Gal,且主要分布于细胞膜与细胞质中;在细胞核部分,BHK-21细胞核有SAα2,3Gal受体分布,而DF-1细胞核中两种受体均有分布。其次,本研究应用流式细胞仪对5种细胞膜表面的两种唾液酸受体进行了定量分析,结果显示5种细胞表面SAα2,3Gal受体的含量显着高于SAα2,6Gal受体,提示5种细胞主要以SAα2,3Gal受体为主;按由多到少排列,SAα2,3Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、BHK-21、DF-1、LMH与Vero细胞;SAα2,6Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、LMH、BHK-21、Vero与DF-1细胞。结合NDVⅠ系与Lasota株在不同细胞上的增殖特性的比较,可判断NDVⅠ系更易与SAα2,3Gal受体结合,NDV Lasota株更易与SAα2,6Gal受体结合。NDV虽然可在多种细胞上增殖培养,但效价普遍较低,不能达到生产要求。NDV的两种唾液酸受体分别为SAα2,3Gal和SAα2,6Gal,而介导两种唾液酸受体形成的酶类分别是ST3Gal转移酶和ST6Gal转移酶,因此唾液酸转移酶对唾液酸受体在细胞表面的表达具有重要作用,而细胞表面受体表达丰度的高低对病毒入侵与增殖具有决定性作用。因此,为了提高NDV细胞培养效价及进一步确定不同唾液酸受体对NDV细胞培养的影响,本研究以PCI-neo为载体,在成功构建唾液酸转移酶PCI-neo-ST3与PCI-neo-ST6质粒的基础上,应用脂质体转染的方法将其分别转染BHK-21细胞,共获得22株BHK-ST3细胞与17株BHK-ST6细胞;进而将NDV Lasota株分别接种以上细胞,通过HA效价及TCID50的测定,分别获得了较适于NDV Lasota株增殖的BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞克隆株。流式细胞仪检测发现,BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞表面相应的唾液酸受体表达丰度均有显着提高,且BHK-ST6-15细胞较BHK-ST3-22细胞更适合于NDV Lasota株的增殖。为了提高NDV在BHK-ST6-15细胞株的增殖效价,本研究在对应用BHK-ST6-15贴壁细胞增殖培养NDV Lasota株的条件进行优化的基础上,一方面将BHK-ST6-15细胞进行低血清悬浮培养的驯化;另一方面对NDV Lasota株在悬浮培养的BHK-ST6-15细胞上增殖条件进行了优化。结果显示,成功实现了BHK-ST6-15细胞的低血清悬浮培养,应用该细胞增殖培养NDV Lasota株,其细胞培养液效价可达108.375 TCID50/0.1 mL,显着高于BHK-ST6-15贴壁细胞,从而为实现NDV Lasota株细胞悬浮培养产业化生产奠定了良好基础。我国家禽活疫苗的生产主要依靠接种SPF鸡胚制备而成,该工艺主要存在批次间稳定性差、家禽外源病毒污染的风险和鸡胚废弃物无害化处理等问题,因此,影响着家禽活疫苗的生产。为替代传统鸡胚生产工艺、提升产品质量与效益,本研究应用全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗,并根据《中华人民共和国兽药典》2015年版三部的要求对其进行检测。结果显示,NDV Lasota株活疫苗各项指标均符合要求,可完全替代传统鸡胚生产工艺。同时,该技术具有技术成熟、自动化程度高、安全性强、产品质量稳定等优点,且显着降低了生产成本、提高了经济效益,从而为全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗奠定了良好基础。
白雪雁[9]（2019）在《表达基因Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株构建及其免疫效力试验》文中提出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus）引起的禽类急性、烈性、高度接触性传染病。近年来,在我国流行的NDV强毒株主要是基因VII型,而广泛使用的La Sota疫苗毒株是基因II型。虽然La Sota疫苗对基因VII型NDV毒株可提供良好的临床保护,但是并不能有效阻止感染禽的排毒。因此,研制与NDV流行毒株基因型相匹配的疫苗对于ND的防控具有重要意义。火鸡疱疹病毒（HVT）FC126株在抗原性上与马立克氏病毒（MDV）相近,常用于鸡马立克氏病（MD）的预防。由于HVTFC126株的基因组含有较多可供外源基因插入的复制非必需区,同时又可以冻干保存,常作为禽用重组病毒疫苗的载体。融合（F）蛋白是NDV囊膜表面的主要糖蛋白,与NDV的致病性直接相关,也是主要保护性抗原。本研究以HVT FC126株的US2复制非必需区作为外源基因的插入位点,构建表达基因VII型NDVF蛋白的重组病毒疫苗株;此外,还将构建缺失F蛋白跨膜区的重组病毒,以期将表达的F蛋白分泌到重组病毒囊膜外,避免机体内抗体的中和作用,并评价了两株重组病毒疫苗的免疫效力首先构建含HVT FC126株外源基因插入位点处上下游序列的中间质粒pCR2.1-US2,然后将EGFP基因表达盒克隆到此中间质粒,获得转移载体质粒pCR2.1-US2-EGFP;采用磷酸钙共沉淀法,将pCR2.1-EGFP和HVT FC126株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经同源重组获得表达EGFP的重组病毒rHVT-EGFP。采用与上述类似的方法和步骤,用基因VII型NDV F基因表达盒替代rHVT-EGFP的EGFP基因表达盒,构建表达NDVF蛋白的重组病毒。以基因VII型NDVDT2014毒株基因组为模板,采用RT-PCR扩增其F基因。将F基因插入至真核表达载体pEASY（?）-M3中,再经PCR扩增含CMV启动子、TK ployA终止子和Flag标签的F基因表达盒。将F基因表达盒克隆到中间质粒pCR2.1-US2,构建转移载体pCR2.1-US2-F。对F基因的跨膜区进行分析,显示F蛋白含有两个跨膜区,分别位于117-139和502-525位氨基酸的位置;以pCR2.1-US2-F为模板,采用重叠延伸PCR的方法分别对两个跨膜区进行缺失,构建缺失跨膜区的转移载体pCR2.1-US2-△F。分别将pCR2.1-US2-F和pCR2.1-US2-△F与rHVT-EGFP基因组DNA共转染CEF,拯救出两株重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-△F。用有限稀释法对重组病毒进行反复纯化,直至病毒蚀斑在荧光显微镜下观察均不带荧光。通过PCR验证,F基因正确插入到重组病毒基因组。以基因Ⅶ型NDV的阳性血清为一抗,进行间接免疫荧光试验,两株重组病毒均呈阳性反应;以Flag标签蛋白作为一抗,进行Western-blot试验,重组病毒rHVT-NDV-VII-F成功表达了约55kDa和60kDa的目的条带,重组病毒rHVT-NDV-VII-△F成功表达约60kDa的目的条带。两株重组病毒在CEF细胞上的生长特性与HVT FC126株疫苗毒株相似。为了评价重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-△F的免疫效力,用1日龄SPF鸡进行了动物试验。动物试验分组依次是:rHVT-NDV-VII-F组、rHVT-NDV-VII-△F组、弱毒疫苗组、攻毒对照组、空白对照组,每组各20只鸡。首先对rHVT-NDV-VII-F组和rHVT-NDV-VII-△F组的1日龄鸡只进行免疫接种,颈部皮下注射相应的重组病毒,剂量为5000蚀斑形成单位（PFU）/鸡;弱毒疫苗组则在鸡只7日龄时,接种La Sota疫苗。除空白对照组外,其余各组于鸡只21日龄时攻毒,以滴鼻点眼的方式接种105EID5o/鸡的NDV DT-2014株。攻毒后连续观察14天,统计各实验组的临床症状和死亡率。并于攻毒后第3天,采集各组咽喉、泄殖腔的棉拭样品,提取RNA,以荧光定量PCR的方法检测排毒情况。动物试验结果显示:在攻毒后的第3天,两株重组病毒免疫组的排毒量显着低于攻毒对照组,其中重组病毒rHVT-NDV-VII-F组排毒量最低,其次是重组病毒rHVT-NDV-VII-AF 组。针对 NDV DT-2014 株强毒的攻击,两株重组病毒可使鸡的发病和死亡时间大大推迟,rHVT-NDV-VII-F组的存活率为40%。表明重组病毒rHVT-NDV-VII-F对基因Ⅶ型NDV可提供一定的保护,可望作为预防和控制ND的疫苗候选株。
丁佳欣[10]（2019）在《基因Ⅱ型、Ⅶ型二价新城疫病毒样颗粒的构建及免疫效果评价》文中研究说明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的急性、烈性、高度接触性传染病,在易感家禽中死亡率高达100%,对世界各地的养禽业和贸易往来造成严重经济损失,是世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE）必报动物疫病之一,也是我国重点防控的一类疫病。近年来,我国按照国家总体部署,防控力度加大,疫情发病率总体维持在较低水平。但控制和根除ND绝非易事,尤其当前防控手段主要依赖传统疫苗接种,无法有效阻止病毒感染与复制,造成局部地区病毒污染比较严重,疫情呈持续性地方流行,且传统疫苗均是针对全病毒设计,常规血清学检测方法不能区分野毒感染抗体和疫苗免疫抗体,无法及时、准确地对疫情作出诊断,对ND的监控十分不利。我国养禽业倡导“绿色、安全”养殖模式,在《国家新城疫防治指导意见（2017—2020年）》中明确提出到2020年年底,全国曾祖代、祖代种鸡场达到净化标准。因此,研发一种安全、高效、能有效鉴别野毒感染抗体及疫苗免疫抗体的新型疫苗对ND的防控及净化至关重要。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是由病毒的一种或多种结构蛋白组装而成的纳米级空心颗粒,因形态、大小和自然病毒相似而得名。VLPs适宜的大小及独特的表面结构可被天然免疫细胞和分子有效识别,诱导良好的先天性免疫应答和适应性免疫应答,且VLPs不含有病毒的感染性核酸,安全性较高,近年来成为疫苗领域中的研究热点。本研究立足于VLPs生产平台,以ND的经典商品疫苗株基因II型LaSota株和流行优势基因型强毒株基因VII型NA-1株为研究对象,利用昆虫杆状病毒表达系统,构建以LaSota株的M蛋白为囊膜内部骨架蛋白,囊膜外展示LaSota株及NA-1株的保护性抗原蛋白（F蛋白和HN蛋白）的二价NDV VLPs,并从免疫指标、攻毒保护、体内病毒载量和体外排毒时间四个方面对颗粒疫苗的免疫效果进行评价。同时,针对二价NDV VLPs只含有M、F、HN三种结构蛋白的特点,以NP蛋白为靶点,建立能够鉴别诊断ND野毒感染与VLPs疫苗免疫的ELISA方法。为ND的防控及净化提供安全、高效的候选疫苗株并为其野毒感染抗体和疫苗免疫抗体的鉴别诊断提供新策略。1、二价NDV VLPs的构建与鉴定利用胞外域替换策略,将LaSota株F、HN基因的胞外域替换为NA-1株F、HN基因的胞外域。通过重叠延伸PCR技术将NA-1株F、HN基因的胞外域与LaSota株F、HN基因的胞内域及跨膜区相连,命名为rNA-1 F、rNA-1 HN基因。利用昆虫杆状病毒表达系统表达含有LaSota株M、F、HN基因及rNA-1 F、rNA-1HN基因的重组杆状病毒rBV-LaSota M、rBV-LaSota F、rBV-LaSota HN、rBV-rNA-1 F、rBV-rNA-1 HN。将五种重组杆状病毒同时感染悬浮培养的sf9细胞,96h后收取细胞上清,经纯化后利用SDS-PAGE、Western Blot技术和透射电子显微镜技术鉴定,结果显示目的蛋白均正确表达且组装成与野生型NDV形态大小相似的纳米级颗粒,表明正确构建了含有LaSota株M、F、HN蛋白和NA-1株F、HN蛋白的二价NDV VLPs。2、二价NDV VLPs的免疫效果评价以SPF鸡为实验动物,通过肌注方式免疫不同剂量的二价NDV VLPs。与弱毒商品疫苗相比,血凝抑制试验结果显示颗粒疫苗能快速激发较高水平的HI抗体效价;流式细胞术分析结果显示颗粒疫苗能有效诱导更多的CD3+CD4+T细胞及CD3+CD8+T细胞产生;在两种强毒株（NA-1株和Herts33株）攻击下,颗粒疫苗提供完全保护,且在排毒时间及病毒载量方面呈现出明显优势。3、区分ND野毒感染抗体与VLPs疫苗免疫抗体的ELISA方法建立利用原核表达系统制备NDV NP蛋白,亲和层析法纯化后经SDS-PAGE、Western Blot技术鉴定,结果表明制备的NP蛋白纯度较高,可用于后续实验。随后以NP蛋白为靶点建立间接ELISA方法,对包被量、样品稀释度、抗体工作条件等环节进行优化,并对检测方法的性能进行评价,结果表明建立的ELISA检测方法敏感性、特异性较高,重复性较好,能够准确区分NDV VLPs疫苗免疫及野毒感染的血清样品。综上,本研究正确制备同时含有ND经典商品疫苗株（LaSota株）及流行优势基因型强毒株（NA-1株）保护性抗原蛋白的二价NDV VLPs,免疫后诱导较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,在同源强毒株及异源强毒株的攻击下为免疫鸡群提供100%的临床保护,且在体内病毒载量与体外排毒时间方面均优于传统商品疫苗。同时,以NDV NP蛋白为靶点,建立的间接ELISA检测方法能够对NDV VLPs疫苗免疫抗体和野毒感染抗体进行准确鉴别诊断。为ND的防控及净化奠定基础。
二、鸡新城疫病毒分离株与La Sota株灭活疫苗效力比较试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡新城疫病毒分离株与La Sota株灭活疫苗效力比较试验（论文提纲范文）
（1）新城疫病毒基因Ⅰ/Ⅶ型F和HN基因嵌合弱毒疫苗候选株LX-OAI4S的构建和免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 新城疫疫苗种类及不同的免疫方式 |
| 1 NDV概述 |
| 1.1 NDV简介 |
| 1.2 ND流行情况 |
| 2 ND疫苗种类 |
| 2.1 活疫苗 |
| 2.2 灭活苗 |
| 2.3 ND反向遗传疫苗 |
| 2.4 以NDV为载体构建的疫苗 |
| 2.5 病毒样颗粒疫苗 |
| 2.6 DNA疫苗 |
| 3 免疫方式 |
| 3.1 喷雾免疫 |
| 3.2 其他免疫方式 |
| 3.2.1 传统免疫方式 |
| 3.2.2 鸡胚免疫 |
| 4 本课题研究目的和意义 |
| 第一章 重组嵌合疫苗株LX-OAI4S的构建及滴鼻点眼免疫效力评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 分子生物学试剂和主要化学试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 分子生物学软件 |
| 1.6 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 中间质粒的构建 |
| 2.2.1 中间质粒pLX-F的构建 |
| 2.2.2 中间质粒pLX-FHN的构建 |
| 2.2.3 重组质粒pLXS-S的构建 |
| 2.2.4 全长克隆pLX-OAI4S的构建和鉴定 |
| 2.2.5 质粒的提取 |
| 2.3 病毒拯救 |
| 2.4 获救病毒的鉴定 |
| 2.5 生物学特性的测定 |
| 2.6 嵌合病毒的稳定性试验 |
| 2.7 最小免疫剂量试验 |
| 2.8 不同疫苗株滴鼻点眼免疫效力试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 LX-OAI4S全长克隆构建、病毒拯救和鉴定 |
| 3.2 病毒的生物学特性的测定 |
| 3.3 嵌合病毒稳定性试验 |
| 3.4 最小免疫剂量试验 |
| 3.4.1 免疫后抗体水平变化 |
| 3.4.2 攻毒后剖检及排毒情况 |
| 3.5 不同疫苗株滴鼻点眼免疫效力试验 |
| 3.5.1 免疫后抗体水平变化 |
| 3.5.2 攻毒后排毒情况 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组嵌合疫苗株LX-OAI4S气雾免疫效力评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 喷雾免疫方法 |
| 2.2 喷雾免疫效力试验 |
| 2.2.1 喷雾免疫SPF鸡试验 |
| 2.2.2 喷雾免疫商品鸡试验 |
| 2.3 喷雾免疫抗体监测试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床观察结果 |
| 3.2 免疫后抗体水平变化 |
| 3.3 对鸡的生长性能的影响 |
| 3.4 免疫后剖检结果 |
| 3.5 攻毒后排毒情况 |
| 3.6 抗体监测试验 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）新城疫疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 新城疫概述 |
| 2 新城疫疫苗 |
| 2.1 活疫苗 |
| 2.2 灭活疫苗 |
| 2.3 病毒样颗粒疫苗 |
| 2.4 亚单位疫苗 |
| 2.5 活载体疫苗 |
| 2.6 核酸疫苗 |
| 3 研究展望 |
（3）基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病料 |
| 1.1.2 SPF鸡胚及实验动物 |
| 1.1.3 标准抗原、阳性血清及毒株 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 疫苗 |
| 1.1.6 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.2.2 F基因高变区序列的测定和遗传进化分析 |
| 1.2.3 病毒致病指数测定 |
| 1.2.4 鸡胚交叉中和试验 |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2 F基因高变区序列的测定和遗传进化分析 |
| 2.3 分离株致病指数的测定 |
| 2.4 鸡胚交叉中和试验结果 |
| 2.5 攻毒保护试验 |
| 2.5.1 免疫后抗体水平检测结果 |
| 2.5.2 免疫后攻毒保护效果 |
| 3 讨论 |
（4）鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗悬浮培养（La Sota株+WL-s株）的免疫效力研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原制备用毒株 |
| 1.1.2 攻毒用毒种 |
| 1.1.3 抗原与疫苗 |
| 1.1.4 种蛋与试验鸡 |
| 1.1.5 主要试剂与设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗原液的制备 |
| 1.2.2 抗原液的浓缩、灭活和灭活检验 |
| 1.2.3“悬浮苗”的制备 |
| 1.2.4 疫苗的检验 |
| 1.2.4. 1 安全试验 |
| 1.2.4. 2 效力试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 抗原液制备、浓缩、灭活和检验 |
| 2.2“悬浮苗”的性状检验、装量检验、无菌检验 |
| 2.3“悬浮苗”与“鸡胚苗”的安全性试验 |
| 2.4“悬浮苗”与“鸡胚苗”的效力试验 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（5）表达新城疫病毒F蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫原性初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡马立克氏病病毒 |
| 1.1.1 火鸡疱疹病毒 |
| 1.1.2 鸡马立克氏病病毒活载体疫苗研究进展 |
| 1.2 新城疫概述 |
| 1.2.1 新城疫病毒 |
| 1.2.2 新城疫病毒流行病学 |
| 1.2.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 第二章 HVT Fosmid粘粒拯救系统的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 疫苗株 |
| 2.1.2 鸡胚和细胞 |
| 2.1.3 主要试剂和实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 HVT扩大培养及基因组提取 |
| 2.2.2 基因组DNA平末端化修饰 |
| 2.2.3 连接和包装 |
| 2.2.4 重组粘粒的鉴定和测序 |
| 2.2.5 亲本株病毒的拯救 |
| 2.2.6 拯救亲本株病毒的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HVT基因组Fosmid文库的构建 |
| 2.3.2 用于病毒拯救的重组粘粒的选择 |
| 2.3.3 拯救病毒rHVT的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 rHVT-NDV-F疫苗株的构建及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 鸡胚和细胞 |
| 3.1.2 疫苗株和质粒 |
| 3.1.3 主要试剂和实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HVT粘粒拯救系统的改造 |
| 3.2.2 表达NDVF基因重组粘粒的构建 |
| 3.2.3 表达NDV F基因重组HVT疫苗株的构建 |
| 3.2.4 rHVT-NDV-F疫苗株PCR鉴定 |
| 3.2.5 rHVT-NDV-F疫苗株目的蛋白表达鉴定 |
| 3.2.6 rHVT-NDV-F疫苗株体外复制能力检测 |
| 3.2.7 重组病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 H4-Kan/ccdb粘粒构建鉴定 |
| 3.3.2 H4-F粘粒的构建鉴定 |
| 3.3.3 rHVT-NDV-F重组病毒的拯救 |
| 3.3.4 rHVT-NDV-F重组病毒PCR鉴定 |
| 3.3.5 rHVT-NDV-F重组病毒目的蛋白表达鉴定 |
| 3.3.6 重组病毒的体外复制动力学鉴定 |
| 3.3.7 重组病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 rHVT-NDV-F重组病毒的免疫保护效力初步评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 疫苗株和病毒 |
| 4.1.2 细胞和雏鸡 |
| 4.1.3 主要实验试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 rHVT-NDV-F重组病毒动物实验分组 |
| 4.2.2 rHVT-NDV-F重组病毒诱导ELISA抗体水平检测 |
| 4.2.3 动物实验攻毒发病情况和排毒检测实验测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 免疫rHVT-NDV-F重组病毒鸡产生抗体水平 |
| 4.3.2 rHVT-NDV-F重组病毒NDV强毒F48E9 株的免疫保护效力评价 |
| 4.3.3 rHVT-NDV-F重组病毒NDV流行株LHLJ/01/06 株的免疫保护效力评价 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 基因组特征 |
| 1.1.2 编码蛋白及其功能 |
| 1.1.3 病毒分类及理化性质 |
| 1.1.4 分子流行病学 |
| 1.2 新城疫疫苗研究概况 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 弱毒疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.3 反向遗传学 |
| 1.3.1 RNA病毒的反向遗传学研究 |
| 1.3.2 反向遗传学在新城疫病毒上的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 多克隆抗体 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 主要设备及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的检测 |
| 2.2.2 病毒全基因组序列的测定 |
| 2.2.3 辅助质粒的构建 |
| 2.2.4 POK12载体的改造 |
| 2.2.5 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 2.2.6 内部基因的构建 |
| 2.2.7 外部基因的构建 |
| 2.2.8 BSR-T7/5细胞的培养 |
| 2.2.9 病毒的拯救 |
| 2.2.10 拯救病毒的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR鉴定 |
| 3.2 全基因组扩增 |
| 3.3 全基因组序列分析 |
| 3.3.1 HB株基因组特征 |
| 3.3.2 编码区序列分析 |
| 3.3.3 非编码区序列分析 |
| 3.3.4 F蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3.5 HN蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3.6 遗传进化分析 |
| 3.4 辅助质粒的构建 |
| 3.5 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 3.5.1 POK12载体的改造结果 |
| 3.5.2 内部基因和外部基因扩增 |
| 3.6 F蛋白的改造结果 |
| 3.7 拯救病毒的鉴定 |
| 3.7.1 鸡胚病变 |
| 3.7.2 遗传标记检测 |
| 3.7.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.7.4 拯救病毒在细胞上的病变 |
| 3.7.5 拯救病毒的TCID50 |
| 3.7.6 拯救病毒的生长特性分析 |
| 3.7.7 F蛋白裂解位点测序结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HB株全基因组序列分析 |
| 4.2 NDV弱毒株感染性克隆的构建 |
| 4.3 F蛋白裂解位点的改造 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒M41株低免疫鸡胚同胚培养研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 种毒不同稀释比例的对比试验 |
| 1.3.2 不同培养温度的对比试验 |
| 1.3.3 孵育和观察 |
| 1.3.4 收取尿囊液 |
| 1.3.5 EID50测定 |
| 1.3.6 鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联灭活疫苗（La Sota株+M41株）的制备及效力对比试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 种毒不同稀释比例的对比试验结果 |
| 2.2 不同温度培养试验结果 |
| 2.3 鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗（La Sota株+M41株）效力检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 影响同胚接种培养的主要因素 |
| 3.2 影响病毒液收获量的主要因素 |
| 3.3 与单胚接种培养和免疫效果的差异 |
| 4 结论 |
（8）鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 副黏病毒概述 |
| 1.2 NDV的病原学概述 |
| 1.3 NDV分子生物学特性 |
| 1.4 NDV在宿主细胞内的复制增殖 |
| 第二章 新城疫病毒受体研究进展 |
| 2.1 病毒受体特性 |
| 2.2 NDV的唾液酸受体 |
| 2.3 与唾液酸受体相关的酶类 |
| 2.4 影响NDV与受体结合的因素 |
| 2.5 NDV唾液酸受体的分布 |
| 2.6 NDV培养特性 |
| 第三章 新城疫疫苗研究概况 |
| 3.1 常规疫苗 |
| 3.2 新型疫苗--基因工程疫苗 |
| 第二篇 实验研究部分 |
| 第一章 不同细胞系培养NDV特性的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 唾液酸受体SAα2,3Gal和 SAα2,6Gal在不同细胞系表达的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达唾液酸转移酶细胞株的建立与筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV Lasota株在BHK-ST6-15 细胞上培养条件的优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基于BHK-ST6-15 全悬浮细胞培养的NDV Lasota株活疫苗的试验研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）表达基因Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株构建及其免疫效力试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 NDV的病原学 |
| 1.1 NDV的分类与形态结构 |
| 1.2 NDV的理化特性 |
| 1.3 NDV的增殖特性 |
| 1.4 NDV的生物学活性 |
| 1.4.1 血凝活性 |
| 1.4.2 神经氨酸酶活性 |
| 1.4.3 细胞融合与溶血活性 |
| 1.4.4 抗肿瘤的作用 |
| 1.5 NDV的致病性 |
| 2 F蛋白的结构及功能 |
| 3 NDV疫苗的研究进展 |
| 3.1 活疫苗 |
| 3.2 灭活疫苗 |
| 3.3 基因工程疫苗 |
| 3.3.1 亚单位疫苗 |
| 3.3.2 重组活载体疫苗 |
| 4 新城疫的流行病学 |
| 第二章 表达基因Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株构建及其免疫效力试验 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体和菌株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组病毒rHVT-EGFP的纯化 |
| 2.1.1 rHVT-EGFP重组病毒的构建 |
| 2.1.2 重组病毒rHVT-EGFP的纯化与扩大培养 |
| 2.1.3 重组病毒rHVT-EGFP的基因组的提取 |
| 2.1.4 重组病毒rHVT-EGFP的转染 |
| 2.2 新城疫病毒株(DT-2014)F基因的克隆与鉴定 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR扩增NDV F基因 |
| 2.2.4 中间质粒pM3-F的构建 |
| 2.3 转移载体pCR2.1-US2-F和pCR-US2-AF的构建 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 F基因表达盒的PCR扩增 |
| 2.3.3 中间质粒pCM V-F的构建 |
| 2.3.4 转移载体pCR-US2-F的构建 |
| 2.3.5 转移载体pCR-US2-△F的构建 |
| 2.4 转移载体pCR2.1-US2-F和pCR2.1-US2-AF的鉴定 |
| 2.4.1 酶切鉴定 |
| 2.4.2 Western-blot试验鉴定 |
| 2.4.3 间接免疫荧光试验(IFA)鉴定 |
| 2.5 重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-AF的拯救与纯化 |
| 2.5.1 转移载体的线性化 |
| 2.5.2 重组病毒rHVT-EGFP的提取 |
| 2.5.3 重组病毒的拯救 |
| 2.6 重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-AF的鉴定 |
| 2.6.1 PCR鉴定重组病毒 |
| 2.6.2 间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组病毒F蛋白表达 |
| 2.6.3 Western-blot试验鉴定重组病毒F蛋白的表达 |
| 2.6.4 重组病毒的效价测定试验 |
| 2.6.5 重组病毒在CEF上的生长特性 |
| 2.7 重组病毒针对NDV的免疫保护评价 |
| 2.7.1 重组病毒的免疫保护试验 |
| 2.7.2 排毒检测 |
| 2.7.3 不同试验组在攻毒后的生存曲线 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组病毒rHVT-EGFP的纯化 |
| 3.2 真核表达载体pCR2.1-US2-F的构建 |
| 3.2.1 F基因的克隆鉴定 |
| 3.2.2 F基因表达盒的扩增 |
| 3.2.3 转移载体的酶切鉴定 |
| 3.2.4 转移载体Western-blot试验鉴定 |
| 3.2.5 转移载体间接免疫荧光(IFA)试验鉴定 |
| 3.3 重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-AF的拯救与鉴定 |
| 3.3.1 重组病毒的拯救 |
| 3.3.2 PCR鉴定重组病毒的F基因 |
| 3.3.3 PCR鉴定重组病毒F基因的表达盒 |
| 3.3.4 IFA试验鉴定重组病毒F蛋白的表达 |
| 3.3.5 Western-blot鉴定重组病毒F蛋白的表达 |
| 3.3.6 重组病毒的效价 |
| 3.3.7 重组病毒的生长曲线 |
| 3.4 重组病毒对NDV强毒的免疫保护试验 |
| 3.4.1 绝对荧光定量PCR检测排毒 |
| 3.4.2 不同试验组在攻毒后的生存曲线和保护率 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）基因Ⅱ型、Ⅶ型二价新城疫病毒样颗粒的构建及免疫效果评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 新城疫与新城疫病毒的研究进展 |
| 1.1 新城疫的发展现状 |
| 1.2 新城疫病毒的结构基础及致病性 |
| 1.3 新城疫商品疫苗的研究现状 |
| 1.4 新城疫的鉴别诊断方法 |
| 第2章 病毒样颗粒的研究进展 |
| 2.1 病毒样颗粒概述 |
| 2.2 病毒样颗粒表达系统 |
| 2.3 病毒样颗粒疫苗与免疫应答 |
| 2.4 新城疫病毒样颗粒疫苗的研究现状 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 基因II型、VII型二价新城疫病毒样颗粒的构建与制备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 二价新城疫病毒样颗粒的免疫效果评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 区分新城疫野毒感染与VLPs疫苗免疫的间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、鸡新城疫病毒分离株与La Sota株灭活疫苗效力比较试验（论文参考文献）
- [1]新城疫病毒基因Ⅰ/Ⅶ型F和HN基因嵌合弱毒疫苗候选株LX-OAI4S的构建和免疫效力评价[D]. 姚瑶. 扬州大学, 2021
- [2]新城疫疫苗研究进展[J]. 蔡俊呈,陈礼斌,张殿宸,林秋燕,向斌,廖明,徐成刚,任涛. 养禽与禽病防治, 2021(03)
- [3]基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究[J]. 薛景景,侯瑞卿,王婉冰,张盼涛,袁月,郭丽霞,张哲,田辉,刘武杰,田克恭. 动物医学进展, 2021(02)
- [4]鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗悬浮培养（La Sota株+WL-s株）的免疫效力研究[J]. 董婷婷,马宁宁,姜磊,张凌云,侯野,郑杰,张乾顺,肖龙,徐宏军. 中国家禽, 2020(11)
- [5]表达新城疫病毒F蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫原性初步评价[D]. 许曾焜. 中国农业科学院, 2020
- [6]基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救[D]. 孟令宅. 河北农业大学, 2020(01)
- [7]新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒M41株低免疫鸡胚同胚培养研究[J]. 刘晓民,张庆霞,任国鑫,李恒永,周振成,李县斌,郭洪武,李雪娇. 中国家禽, 2020(05)
- [8]鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用[D]. 董炳梅. 吉林大学, 2019
- [9]表达基因Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株构建及其免疫效力试验[D]. 白雪雁. 扬州大学, 2019
- [10]基因Ⅱ型、Ⅶ型二价新城疫病毒样颗粒的构建及免疫效果评价[D]. 丁佳欣. 吉林大学, 2019(11)